Name: استخراج F420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل Polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: اكتشف طريقة استخراج محسّنة لتحليل العامل المساعد F420 من الثقافات النقية والعينات البيئية باستخدام الفصل الكروماتوغرافي السائل. تُحسّن هذه التقنية فهم التمثيل الغذائي في بدائيات النوى.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر البروفيسور كولين جاكسون بامتنان على الدعم الذي تقدمه لك شركة F420 المساعدة المنقى. تم دعم هذا البحث من قبل صندوق العلوم التيرولية (TWF) وجامعة إنسبروك (Publikationsfonds). ونحن نعترف كثيرا بدعم نظام تحديد المواقع، هونج كونج، SB، GG، وHB.

ملاحظة: استخراج وتحليل F420 عامل مساعد هو عملية من ثلاث خطوات بما في ذلك تحلل العينة، مساعد قبل تنقية عن طريق استخراج المرحلة الصلبة (SPE)، والكشف عن عامل مساعد عن طريق أيون-يقترن-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) مع الكشف عن الفلورية. قبل البدء، قم بإعداد المواد والكواشف كما هو مذكور في الجدول 1.
1. تحلل العينة
<ol><li>إضافة ما يصل إلى 5 غرام من العينة إلى أنابيب مناسبة (على سبيل المثال، 50 مل أنابيب مخروطية).</li>
	<li>إضافة 5 مل من المخزن المؤقت تحلل (2x حل المخزون، الجدول 1) إلى العينات.</li>
	<li>أحضر إلى الحجم النهائي من 10 مل مع الماء المقطر للوصول إلى تركيز نهائي من 0.5 غرام · مل-1.</li>
	<li>دوامة العينات المخففة لمدة 20 s.</li>
	<li>الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.</li>
	<li>لعينات جافة مثل التربة الحرجية، وجلب إلى حجم النهائي من 20 مل مع الماء المقطر بعد autoclaving ودوامة العينة المخففة. تنبيه: قد تؤدي زيادة درجة الحرارة أثناء الالاستعباد التلقائي إلى انفجار الأنابيب.</li>
</ol>2. قبل تنقية عامل مساعد F 420 عن طريق استخراج المرحلة الصلبة (SPE)
ملاحظة: يتم إجراء جميع الخطوات من SPE في درجة حرارة الغرفة
<ol><li>تهدئة العينات لدرجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>الطرد المركزي عينات autoclaved لمدة 5 دقائق في 11000 x ز.</li>
	<li>إعداد 5 مل أعمدة SPE مليئة 100 ملغ من أنيون ضعيف مختلطة وضع البوليمرية ماصة.</li>
	<li>شرط مبادل أنيون مع 3 مل من الميثانول (حل الشرط، الجدول 1).</li>
	<li>إعادة توازن مبادلة أنيون مع 3 مل من الماء المقطر (حل التوازن، الجدول 1).</li>
	<li>تحميل ما يصل إلى 9.0 مل من supernatant من lysate الطرد المركزي على العمود SPE.</li>
	<li>غسل الشوائب مع 5 مل من خلات الأمونيوم 25 mM (SPE غسل الحل 1، الجدول 1).</li>
	<li>غسل الشوائب مع 5 مل من الميثانول (SPE غسل الحل 2، الجدول 1).</li>
	<li>Elute عامل F420 المساعد في 1.0 مل من المخزن المؤقت elution (الجدول 1). ملاحظة: تحضير المخزن المؤقت elution جديدة. بسبب الفراغ المطبق وضغط البخار العالي لحاجز الغضوء ، قد تختلف أحجام الغضوء من عينة إلى عينة. من أجل تأمين نفس الحجم النهائي في جميع العينات ، يوصى بوزن سفن التجميع قبل وبعد الوضوء وحساب حجم elution الفعال. موازنة الاختلافات بإضافة المخزن المؤقت elution.</li>
</ol>3. الكشف عن F420 مساعد
<ol><li>تعيين الفرن إلى 40 درجة مئوية وكاشف مضان إلى 420 نانومتر الانقراض الطول الموجي و 470 نانومتر الانبعاثات الطول الموجي. تحقيق الفصل عبر وضع التدرج باستخدام المرحلتين المتنقلتين A و B (الجدول 1): 0-3 دقيقة: 26٪ B؛ 3-24 دقيقة: 26٪ -50٪ B؛ 24-25 دقيقة: 50٪ ب; 25-27 دقيقة: 50٪ -26٪ B؛ 27-35 دقيقة: 26٪ ب بمعدل تدفق 0.75 مل·دقيقة-1. ملاحظة: ضمان توازن ظروف العمود قبل حقن العينات عن طريق مسح العمود على الأقل بأحجام عمود 3 من المرحلة المتنقلة A بنسبة 74٪ والمرحلة B المتنقلة بنسبة 26٪ (الجدول 1).<ol>
<li>تصفية العينات eluted من SPE إلى قوارير HPLC باستخدام مرشح PTFE مع حجم المسام من 0.22 ميكرومتر. ملاحظة: يوصى بفلاتر PTFE بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.</li>
		<li>حقن 50 ميكرولتر من العينة المتبلورة على نظام HPLC لتحليل تكوين F420 المساعد وتركيزه. ملاحظة: بما أنه لا يوجد معيار كمي مستخدم في هذا البروتوكول، يجب مقارنة العينات والمتغيرات حسب منطقة الذروة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
<li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li>
<li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).</li>
<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

لتقييم F420 عامل مشارك من الثقافات النقية الميثانوجينية، يمكن إجراء تقييم مجهري لتصور النمو والنشاط (المجهر الفلوري) للكائنات الحية الدقيقة المعنية (الشكل 1). بالنسبة للعينات المستمدة من البيئات الطبيعية، فإن استخدام المجهر للكشف عن F420 أو قياسه كميا محدود بسبب التداخلات مع الكائنات الحية الدقيقة الفلورية الأخرى والجسيمات العضوية وغير العضوية. وفي هذا السياق، فإن استخراج F420 والتحليل الفلوري اللاحق باستخدام HPLC، كما هو موضح سابقا5، ...

F420 هو عامل مساعد واسع الانتشار ولكنه مهمل في كثير من الأحيان ، والذي يعمل كحامل هيدريد إلكترونين ملزم في عمليات التمثيل الغذائي الأولية والثانوية لكل من Archaea و Bacteria1،2. F420 هو 5-deazaflavin ويشبه هيكليا فلافينس، حيث خصائصه الكيميائية والبيولوجية هي أكثر قابلية للمقارنة مع تلك التي NAD + أو NADP +. بسبب استبدال النيتروجين مع الكربون في موقف 5 من حلقة ايزالوكسازين، بل هو اختزال قوي، وبالتالي تظهر إمكانات الأكسدة القياسية منخفضة من -340 mV1،3. F420 يتكون من حلقة 5-deazaflavin و2-فوسفو-L-لاكتات رابط (F420-0). يمكن إرفاق ذيل oligoglutamate الذي يحتوي على مونومرات الغلوتامات n+1 بالجزيء (F420-n+1)4.
لفترة طويلة، ارتبط العامل المساعد F420 فقط مع Archaea وActinobacteria. وقد انقلب هذا إلى حد كبير. كشفت التحليلات الحديثة أن F420 يتم توزيعها بين الكائنات اللاهوائية والهوائية المتنوعة من فيلا بروتيوبكتيريا، كلوروفليكسي، وربما Firmicutes التي تسكن عددا لا يحصى من الموائل مثل التربة والبحيرات، والأمعاء البشرية1،5. في عام 2019 ، أظهر Braga et al.6 ، أن البروتيوباكتيريوم Paraburkholderia rhizoxinica ينتج مشتق F420 فريد من نوعه ، يحتوي على 3 فوسفوغليسيرات بدلا من ذيل 2 فوسفولاكت ، والذي قد يكون واسع الانتشار في موائل مختلفة. داخل مجال Archaea، تم العثور على F420 في عدة أنساب، بما في ذلك ميتانوجينيك7، ميتانوتروبيك8،9، وأوامر خفض الكبريتات10، ومن المفترض أن يتم إنتاجها في Thaumarchaeota11. ومن المعروف F420 كما انزيم الأكسدة الأساسية في هيدروجينوتروبيك والميثيلوتروبيك ميتانوجينيسيس. يعمل الشكل المنخفض من F420 (F420H2) كمتبرع إلكترون للحد من الميثيلينتيتراهيدروميثانوبتيرين (ميثيلين-H4MPT، مير) والميثنيل-H4MPT12,13. ويمكن أيضا أن تستخدم كناقل إلكترون في مسارات نقل الإلكترونات المستقلة H2 من الميثانوجينات التي تحتوي على السيتوكروم12,14. وعلاوة على ذلك، فإن الشكل المؤتأكسد من F420 له مضان أزرق وأخضر مميز عند الإثارة عند 420 نانومتر، مما يسهل الكشف عن الميثانوجينات مجهريا (الشكل 1). نظرا لانخفاض إمكانات الأكسدة ، يسهل F420 (1) التخفيض الخارجي طيف واسع من المركبات العضوية المتمردة أو السامة ، '2' تركيب المضادات الحيوية التتراسيكلين واللينكوساميد أو السموم النباتية في الستربتوميسيتات (فيلوم أكتينوباكتيريا)، و'3' مقاومة الإجهاد التأكسدي أو النيتروزيفي أو غيرها من الظروف غير المواتية في البكتيريا الفطرية (فيلوم أكتينوباكتيريا)1،5،15، 16,17,18,19,20,21,22. وبالتالي، تعد الاكسيدuctases المعتمدة على F420 بالمواد الحيوية الواعدة للأغراض الصناعية والصيدلانية وكذلك للمعالجة البيولوجية للبيئات الملوثة1،23. على الرغم من هذه النتائج الأخيرة ، فإن الأدوار الدقيقة للمتبرع المساعد F420 لا تزال معروفة بشكل هامشي في Actinobacteria أو الفيلا البكتيرية الأخرى.
هناك ما لا يقل عن ثلاثة مسارات لF420 التمثيل الحيوي2،6،24. في البداية ، يتم تقسيم مسار التمثيل الحيوي إلى التمثيل الحيوي 5-deazaflavin وفرع التمثيل الغذائي 2-phospholactate. يتم تصنيع الجزء التفاعلي من جزيء F420 عن طريق FO-synthase باستخدام التيروزين الركيزة و5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H)-pyrimidinedione. والنتيجة هي مستوى الريبوفلافين كروموفور FO. داخل فرع التمثيل الغذائي لللاكتات المقبول حاليا، L-lactate هو الفوسفور إلى 2-فوسفو-L-اللاكتات بواسطة كيناز L-لاكتات (CofB)؛ 2-فوسفو-L-لاكتات، بدوره، هو guanylated إلى L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine بواسطة 2-فوسفو-L-لاكتات جوانيليلترانسفيراز (CofC). في الخطوة التالية، يرتبط L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine إلى FO عن طريق نقل 2-فوسفو-L-لاكتات (CofD) لتشكيل F420-02. وأخيرا، فإن إنزيم F420-0:ɣ-الجلوتاميل ليجاز (CofE) ليغامات مونومرات إلى F420-0، وتشكيل المساعد النهائي6 في أرقام مختلفة23،25. تظهر الكائنات الحية المختلفة أنماطا مختلفة في عدد بقايا الغلوتامات المرفقة ، مع ذيول أقصر وجدت للميثانوجينات مما كانت عليه في البكتيريا الفطرية2،25،26. عموما، تظهر methanogens أطوال الذيل من اثنين إلى ثلاثة، مع ما يصل إلى خمسة في ميثانوجين الأسيتوكلاستيك، ميثانوساركينا sp.، في حين أن أطوال الذيل وجدت في Mycobacterium sp. تراوحت بين خمسة إلى سبعة بقايا الغلوتامات2،25،26،27. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن سلسلة طويلة F420 يربط إلى oxidoreductases F420 تعتمد مع تقارب أعلى من F420 سلسلة قصيرة؛ وعلاوة على ذلك، ملزمة سلسلة طويلة F420 يزيد من تقارب الركيزة ولكن يقلل من معدل دوران الإنزيمات المعنية23.
غالبا ما يعتمد الكشف عن F420 المساعد على مضانه. وبالتالي، تم فصل مشتقات الغلوتامات الأوليغو باستخدام المرحلة المعكوسة (RP) -HPLC27,28. في الآونة الأخيرة، استخدم Ney وآخرون هيدروكسيد رباعي البوتيلامونيوم ككواشف اقتران أيون لذيل الغلوتامات المشحون سلبيا لتعزيز الفصل على RP-HLPC بنجاح5. هنا، نقدم طريقة لإعداد العينات، وتحلل لاحق، واستخراج، وتنقية، وفصل، وتكميم F420 عامل مساعد ليس فقط من الثقافات النقية ولكن أيضا من عينات بيئية مختلفة (أي التربة والحمأة هاضم).

<table><tbody><tr><td>نظام HPLC المتوافق حيويا الأوتوكلاف</td><td></td><td></td>مجهز بجهاز التدرج والفرن وكاشف التألق نظام Shimadzu <td></td> HPLC</tr><tr><td></td> وجهاز الطرد المركزي والدوار لمدة 50 مل "<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> فالكون" أنابيب (11.000 RCF) والأنابيب</td><td></td><td></td><td></td>المناسبة</tr><tr><td>HPLC العمود: الجوزاء NX C18 ، 5 & م ، 150 × 3 مم</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC عمود</td></tr><tr><td>مرشح PTFE (حجم المسام 0.22 ومايكرو ؛ م) لإزالة الجسيمات قبل تحليل</td><td></td><td></td><td></td>HPLC</tr><tr><td>راتنج ل SPE: Strata-X-AW 33 & mu ؛ م مثل الأنيون الضعيف ماصة البوليمرية ذات الوضع المختلط</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>الأنيون الضعيف مادة ماصة بوليمرية</td></tr><tr><td>مختلطة مشعب فراغ ل SPE وأنابيب التجميع المناسبة معدات</td><td></td><td></td><td>SPE</td></tr><tr><td>خلاط</td><td></td><td></td><td></td> دوامة</tr></tbody></table>

استخراج f420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

يلعب العامل المساعد F420 دورا مركزيا كحامل هيدريد في عملية التمثيل الغذائي الأولي والثانوي للعديد من الأمراض البكتيرية والأركيولوجية. يشتهر المتبرع المساعد بدوره في تكوين الميثانوجينيز ، حيث يسهل ردود الفعل الصعبة ديناميكيا حراريا. وبما أن ذيل البولي غلوتامات يختلف في الطول بين الكائنات الحية المختلفة، فإن تحليلات الملف الشخصي للطول قد تكون أداة قوية لتمييز وتميز مختلف المجموعات والمسارات في مختلف الموائل. هنا، يصف البروتوكول استخراج وتحسين الكشف عن F420 العامل المساعد من خلال تطبيق استخراج المرحلة الصلبة جنبا إلى جنب مع تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء مستقلة عن النهج البيولوجية الثقافية أو الجزيئية. تم تطبيق هذه الطريقة للحصول على معلومات إضافية حول التعبير عن F420 العامل المساعد من المجتمعات الميكروبية في التربة والحمأة اللاهوائية والثقافات النقية وتم تقييمها من خلال تجارب التصاعد. وبالتالي، نجحت الدراسة في توليد ملامح مختلفة F420 الذيل طول لmhanogens هيدروجينية وacetoclastic في الثقافات النقية الميثانوجينية الخاضعة للرقابة، وكذلك من العينات البيئية مثل حمأة هاضم اللاهوائية والتربة.

نمت الثقافات النقية من ميتانوساركينا ثيرموفيليا وميثانوكاليوس ثيرموفيليوس، وكلاهما حرارة ميتانوجينيك Archaea، في وسائل الإعلام المناسبة كما هو موضح سابقا29،30. وبالنسبة لميثانوسارسينا ثيرموفيليا، استخدم الميثانول كمصدر للطاقة، في حين أن ميثانوكوليوس ثيرموفيليوس كان يزرع على H2/CO2. وتم فحص النمو عن طريق التقييم المجهري، في حين تم فحص النشاط عن طريق قياس الميثان (CH4) عن طريق كروماتوغراف...

تم تحسين طريقة لاستخراج F420 عامل مساعد من الثقافات النقية لفصل الكروماتوغرافي السائل وتحليل طول ذيل F420 في عينات الثقافة البحتة والبيئة.

استخراج F420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل Polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

يلعب العامل المساعد F420 دورا مهما في عملية التمثيل الغذائي الأولي والثانوي للعديد من البروكاريوت. إن قياس هذا الجزيء في العينات البيئية يمكن من فهم أعمق لانتشاره ووظيفته. هذه التقنية تمكن من تحليل عامل المساعدة في مواد العينة الصعبة مثل الحمأة والتربة.وبالتالي فإن تحلل المواد والتنقية قبل التحليل هي الخطوات المركزية. يتضمن البروتوكول خطوات مختلفة أثناء إعداد العينة. يجب تخطيط هذه الخطوات وإعدادها بشكل جيد جدا قبل البدء في معالجة العينة.على سبيل المثال، إعداد مخازن جديدة مهم. لبدء تحلل العينة، ضع خمسة غرامات من العينة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ثم أضف خمسة ملليلترات من العازلة تحلل 2X إلى العينات، وبذلك حجم إلى 10 ملليلتر مع الماء المقطر للوصول إلى تركيز النهائي من 0.5 غرام لكل ملليلتر.دوامة العينات المخففة لمدة 20 ثانية تليها الالاستعباد التلقائي لمدة 30 دقيقة في 121 درجة مئوية. لعينات جافة مثل التربة الحرجية، وتقديم إلى حجم النهائي من 20 ملليلتر مع الماء المقطر بعد الالاستعباد التلقائي، ودوامة العينة المخففة مرة أخرى لمدة 20 ثانية كما هو موضح. بمجرد أن تبرد العينات ، تقوم أجهزة الطرد المركزي بتنحية العينة لمدة خمس دقائق عند 11000 × غرام ، وجمع الناسخ الفائق.إعداد استخراج المرحلة الصلبة خمسة ملليلتر أو العمود SPE مليئة 100 ملليغرام من ضعف أنيون مختلطة وضع البوليمرية تكييف مبادل أنيون مع ثلاثة ملليلتر من الميثانول. ثم، equilibrate مبادل أنيون مع ثلاثة ملليلتر من الماء المقطر. تحميل ما يصل إلى تسعة ملليلترات من supernatant من lysate الطرد المركزي على العمود SPE.غسل الشوائب من العمود مع خمسة ملليلترات من خلات الأمونيا 25 ملليمولار وخمسة ملليلترات من الميثانول. بعد الغسيل، elute F420 عامل مساعد مع ملليلتر واحد من العازلة elution. مسبقا الفرن إلى 40 درجة مئوية، وتعيين كاشف الفلورسينس إلى 420 نانومتر طول الموجة الانقراض و470 نانومتر الطول الموجي للانبعاثات.بعد ذلك، قم بتصفية العينة التي تم تحريرها من SPE إلى قوارير HPLC باستخدام فلتر PTFE بحجم مسام 0.22 ميكرون. حقن 50 ميكرولتر من العينة المصفاة في نظام HPLC، وفصل F420 المساعد عبر وضع التدرج باستخدام مزيج من مراحل المحمول كما هو موضح في المخطوطة. تحليل تكوين F420 مساعد والتركيز.تم التحقق من نمو الثقافات النقية من الميثانوجينات عن طريق المجهر. في المجهر النقيض من المرحلة ، تكون مجمرات الميثانوجين مرئية ، والتي تنبعث منها ضوء مزرق عندما يكون العامل المساعد F420 متحمسا للأشعة فوق البنفسجية. تم تحليل منطقة الذروة من F420 مساعد تعافى بعد SPE مع كميات مختلفة من الثقافات الحرارية ميتانوكوليوس.حققت استراتيجية التفكك الذاتي أعلى منطقة ذروة ، وخلصت إلى أقصى قدر من كفاءة الاستخراج باستخدام علاج درجة حرارة الضغط. وكشف تحليل توزيع طول الذيل عن الاختلافات في التركيز الكلي للمتبرع المساعد F420 وتوزيع طول ذيل F420 للثقافات الميثانوجينية النقية في العينات البيئية. عند تطبيق هذا الإجراء، يجب أن تكون على علم بتجميع إجمالي حجم المخزن المؤقت elution بالكامل أو تسجيل الحجم الدقيق للتدفق عبر.تمهد هذه التقنية الطريق لاستكشاف F420 العامل المساعد في عينات أكثر تعقيدا مثل التربة والحمأة وتمكن من رؤى أعمق في التأثير البيئي لهذا الجزيء.

extraction-cofactor-f420-for-analysis-polyglutamate-tail-length-from

Research

JoVE Journal

Environment

البيئة

استخراج البروتين لتحليل البروتين في الأنواع الفطرية تتطلب مستويات عالية من التوحيد القياسي لإنجازها وفقا مع الحد الأدنى من المعلومات عن التجربة البروتين (MIAPE) المبادئ التوجيهية. نقدم الفيديو البروتوكول الذي يتضمن إجراء لتقليل التحيز التجريبية خلال تحريض واستخراج السموم من...

التعريفي واستخراج السم من البروتين فيوزاريوم النيابة. الثقافات للدراسات البروتين

التقاط المركبات هي عبارة عن جزيئات صغيرة trifunctional للحد من تعقيد بروتيوم الوظيفية التي عكسها التفاعل جزيء بروتين صغير يليه يشابك - الصور وتنقيتها. نستخدم هنا لقطة مع...

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

وصفت DNA والبروتينات تسلسل تحديدا مع تقارب أو مجموعات مراسل الفلورسنت باستخدام الحمض النووي أو البروتين ميثيل ونظائرها العامل المساعد الاصطناعية. اعتمادا على خصوصية العامل المساعد للأنزيمات، aziridine أو مزدوجة نظائرها العامل المساعد تنشيط يعملون لواحد أو اثنين من خطوة وصفها.

وصفها تسلسل معين من الأحماض النووية والبروتينات مع ميثيل والعامل المساعد النظائر

توفر الأحماض الدهنية فوسفورية المعلومات حول بنية المجتمعات الميكروبية التربة. نحن نقدم طرق لاستخراج عينات من التربة مع الكلوروفورم الخليط على مرحلة واحدة، تجزئة الدهون المستخرجة باستخدام الأعمدة استخراج المرحلة الصلبة، وتحلل الميثانول لإنتاج استرات الميثيل الأحماض الدهنية، والتي يتم تحليلها من قبل اللوني للغاز الشعرية.

استخراج وتحليل الميكروبية الفوسفوليبيدية الأحماض الدهنية في التربة

ويصف المقال طريقة تزيد من الإنتاجية في حين موازنة الجهد والدقة لاستخراج الدهون من أغشية الخلايا من الكائنات الحية الدقيقة لاستخدامها في توصيف كل من الدهون الكلية والوفرة النسبية للدهون مؤشر لتحديد بنية المجتمع الميكروبية التربة في الدراسات مع العديد من العينات.

A استخراج الدهون وتحليل طريقة لتوصيف ميكروبات التربة في تجارب مع العديد من العينات

ويصف هذا البروتوكول إجراء تجريبي للكمية وشاملة التحقيق الأيض من عدة مصادر المغذيات. يسمح سير العمل هذا، استناداً إلى مجموعة من التجارب الراسم النظائر المشعة وإجراء التحليل، مصير المواد الغذائية المستهلكة ومنشأ الأيضية سينثيتيزيد جزيئات من الكائنات الحية الدقيقة تحديد.

سير العمل على أساس المزيج تجارب التتبع النظائري للتحقيق الأيض الميكروبي من عدة مصادر المغذيات

ويقدم بروتوكول لاستخلاص نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة تربة واحدة في وقت واحد، مما يسمح عينة انخفاض إعداد مرات وتمكين متعدد omic الكتلي تحاليل العينات بكميات محدودة.

بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة

ويصف هذا البروتوكول سرعة نقل واحد للتقنيات التحليلية واوميكس تكميلية بلغت ذروتها في توصيف إقران تماما من المواد العضوية الطبيعية والبروتينات الميكروبية في النظم الإيكولوجية المختلفة. ويسمح هذا النهج مقارنات قوية لتحديد المسارات الأيضية والتحولات الهامة لوصف إنتاج غازات الدفيئة والتنبؤ بالاستجابات للتغير البيئي.

واحد الإنتاجية التكميلية التقنيات التحليلية عالية الدقة لوصف خليط معقد من المواد العضوية الطبيعية

التعبير وتنقية البروتينات التي تحتوي على مجال هيدرولاز fumarylacetoacetatee مع أمثلة (التعبير في E. القولونية، FPLC). وتستخدم البروتينات النقية لإنتاج التبلور والأجسام المضادة وتستخدم في اختبارات الإنزيم. يتم تقديم اختبارات ضوئية مختارة لعرض وظائف متعددة من FAHD1 كما ديكاربوكسيلاز أوكسالوأسيتات وأسيلففات هيدرولاز.

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

يصف هذا البروتوكول استخلاص الأحماض الأمينية غير البروتينية من المصفوفات البيولوجية عن طريق ترسيب بروتين حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) والتحلل المائي الحمضي قبل التحليل باستخدام مطياف الكتلة الترادفي اللوني السائل.

استخراج الأحماض الأمينية غير البروتينية من البكتيريا الزرقاء لتحليل الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة

يصف هذا البروتوكول طريقة استخلاص حمض-مذيب ثنائية الطور لعزل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة من عينات براز الفئران منخفضة الإدخال دون اشتقاق.

استخراج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة من براز الفئران باستخدام طريقة الحمض-مذيب ثنائية الطور

اكتشف طريقة استخراج محسّنة لتحليل العامل المساعد F420 من الثقافات النقية والعينات البيئية باستخدام الفصل الكروماتوغرافي السائل. تُحسّن هذه التقنية فهم التمثيل الغذائي في بدائيات النوى.

استخراج _F420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل Polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية

استكشف المزيد من الفيديوهات