Name: Production efficace et évolutive de variantes de huntingtine humaine pleine longueur dans des cellules de mammifères à l’aide d’un système d’expression transitoire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour produire des variantes de huntingtine pleine longueur dans des cellules HEK293. Ce protocole garantit une pureté supérieure à 95 % et facilite la recherche sur la maladie de Huntington.

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Nous remercions le Département des sciences pharmaceutiques de l’Université d’État de New York à Buffalo d’avoir effectué une analyse de la SEP du HTT. Ce travail était un effort de collaboration avec la Fondation CHDI. Nous remercions tout particulièrement Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, Fondation CHDI; et Rory Curtis, Curia, pour leur contribution inestimable lors de la préparation de ce manuscrit. Nous sommes également reconnaissants à Michele Luche, Mithra Mahmoudi et Stephanie Fox pour leur soutien à cet effort de recherche.

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<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
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<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
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<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
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<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
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<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
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<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
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<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.

Nous décrivons ici une méthode transitoire de transfection, d’expression et de purification pour générer de multiples constructions de protéines FL HTT avec une pureté et une homogénéité appropriées pour une utilisation comme normes pour le développement d’immunoessais et de tests MS, de contrôles pour l’analyse par transfert Western et pour les études structure-fonction. Cette méthode d’expression transitoire est évolutive et polyvalente et permet à l’utilisateur de générer des quantités de faibles milligrammes de variantes FL HTT plus efficacement que l’utilisation de lignées cellulaires stables ou de méthodes basées sur des virus décrites précédemment21,22,23,24. Régulièrement, 2 à 5 mg de FL HTT hautement purifié peuvent être générés à partir d’une production de protéines à l’échelle de 2 L en moins d’une semaine en utilisant la méthode d’expression transitoire une fois le plasmide construit, avec un rendement typique de 1 à 2,5 mg de FL HTT par litre de culture cellulaire.
La méthode d’expression transitoire décrite ici surmonte de nombreux obstacles à l’expression de lignées cellulaires stables, tels que le temps nécessaire pour établir les lignées cellulaires et les difficultés de stockage et de maintien de lignées cellulaires stables. Le PEI est également relativement peu coûteux par rapport aux autres réactifs de transfection sur le marché, ce qui rend la transfection à grande échelle économiquement viable. Le protocole comporte également des limites : l’efficacité de la transfection dépend en grande partie de la qualité des plasmides, de la croissance cellulaire optimale et de la qualité du stockage et de la préparation du PEI. Les opérateurs doivent prendre des précautions particulières et effectuer des contrôles de qualité dans ces étapes critiques pour éviter une chute drastique des rendements en protéines. La résine anti-FLAG utilisée dans le protocole est également relativement coûteuse et montre une capture réduite de FL HTT après plusieurs purifications et régénérations. Certains chercheurs peuvent trouver plus pratique de passer à une étiquette différente pour permettre une régénération plus robuste de la résine d’affinité.
Diverses lignées cellulaires et conditions d’expression ont été testées pour optimiser les niveaux d’expression de FL HTT. Les cellules HEK293 ont été choisies pour l’expression de FL HTT en raison de la forte expression des protéines et de la facilité de manipulation dans un format de culture en suspension, ce qui rend la méthode adaptée à une expression à grande échelle dans des agitateurs ou des bioréacteurs. Un niveau d’expression plus élevé de la protéine FL HTT peut être atteint à des températures de culture plus basses telles que 32 ° C plutôt qu’en utilisant la température habituelle de 37 ° C. Il est possible que la température plus basse ralentisse la synthèse des protéines et favorise le repliement correct de FL HTT40. Cependant, ce phénomène n’est pas spécifique à FL HTT ou aux lignées cellulaires testées. La température post-transfection réduite a été largement utilisée dans l’expression des protéines pharmaceutiques dans les cellules CHO. Bien que le mécanisme ne soit pas entièrement compris, on pense que les basses températures arrêtent le cycle cellulaire dans la phase G1 et détournent l’énergie cellulaire vers la production de protéines41.
Le HTT pleine longueur purifié à partir de cellules de mammifères co-élue avec le chaperon Hsp7024, et les étapes de lavage Mg-ATP peuvent éliminer la protéine Hsp70. Fait intéressant, Hsp70 co-élué n’est pas observé dans FL HTT purifié à partir d’un système d’expression cellulaire d’insecte21,22,23. Cela peut refléter une différence dans les PTM de FL HTT ou les réponses protéiques de choc thermique à la surexpression de FL HTT dans les cellules de mammifères et d’insectes. Une fois que la protéine recombinante a été dépouillée de Hsp70, des détergents non ioniques tels que CHAPS ou DDM sont nécessaires pour stabiliser la forme monomère de FL HTT.
Les états d’oligomérisation des variantes FL HTT ont été analysés à l’aide de Blue Native PAGE et SEC-MALS. Une petite fraction de HTT dimérique et oligomère d’ordre supérieur était présente lors de l’analyse par Blue Native PAGE ou SEC-MALS. Il est à noter que les oligomères d’ordre supérieur formés par FL HTT ne semblent pas être en corrélation avec la longueur polyQ, et même le mutant de délétion Exon1 affiche un rapport oligomère-dimère-monomère similaire. Les variations réelles de la teneur en oligomères de ces constructions sont probablement dues à des différences mineures dans la production et la manutention de chaque lot. Contrairement aux agrégats et aux fibrilles formés par HTT Exon140,41, les oligomères d’ordre supérieur de FL HTT sont restés solubles et ont pu être analysés par SEC et Native PAGE.
Le FL HTT monomère purifié n’est que relativement stable. Un stockage prolongé à 4 °C, de courtes incubations à température ambiante ou des concentrations > 1 mg/mL convertiront tous le FL HTT monomère en formes dimères et oligomères d’ordre supérieur, même si aucune précipitation visible n’est observée dans ces conditions. Le FL HTT monomère purifié maintenu à ≤1 mg/mL est resté relativement stable à -80 °C dans un tampon de stockage (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5 % v/v glycérol, 0,5 % p/v CHAPS et 5 mM DTT) comme décrit précédemment24. Jusqu’à 6 cycles de gel-dégel de FL HTT préparés et stockés de cette manière n’ont pas provoqué de précipitation visible de la protéine, bien qu’un léger changement vers un état oligomérique plus élevé ait été observé par SEC-MALS (figure supplémentaire S2). Les échantillons ont également été analysés par SDS PAGE à la suite de cycles répétés de gel-dégel. Aucun précipité visible n’a été observé; aucun agrégat ou produit de dégradation supplémentaire n’a été observé par SDS-PAGE (figure supplémentaire S3). La stabilité à long terme du FL HTT purifié est toujours à l’étude. En l’absence de données concluantes à long terme, nous recommandons de conserver le FL HTT purifié à -80 °C pendant 6 mois maximum.
Les variantes de la protéine FL HTT recombinante de haute qualité et les méthodes pour les produire sont très demandées par la communauté de recherche MH. Ces protéines sont utilisées comme étalons d’immunoessais et d’analyse de la SEP, dans des études structurales et pour le développement de nouveaux tests spécifiques FL HTT. Les méthodes d’expression transitoire à grande échelle décrites ici ont toujours produit des quantités de milligrammes de variantes FL HTT avec une pureté de >95%, fournissant des outils essentiels pour les études HTT. La production de dizaines de milligrammes de variantes polyQ FL HTT hautement purifiées et d’autres mutants à l’appui de la recherche MH est devenue une routine.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative rare caractérisée principalement par des mouvements moteurs instables et involontaires, ainsi que par des altérations cognitives et psychiatriques, telles que des changements de personnalité et de l’apathie 1,2. La MH est associée à une expansion du tractus de répétition CAG situé dans l’exon 1 du gène huntingtin (HTT) à plus de 35 répétitions, avec un nombre plus élevé de répétitions CAG corrélées à une apparition plus précoce de la maladie 3,4. Le produit translationnel de HTT, la protéine huntingtine (HTT), est impliqué dans la viabilité neuronale et le développement du cerveau 5,6,7,8,9.
HTT est une protéine d’échafaudage qui participerait à un large éventail de processus cellulaires, au transport des vésicules, à la division cellulaire, à la ciliogenèse et à l’autophagie10,11. Cependant, la pathogenèse moléculaire de la MH n’est pas tout à fait claire, et l’identification des interacteurs protéiques clés médiant l’impact pathologique du mHTT expansé polyQ fait défaut. Certaines recherches suggèrent un gain de fonction toxique du mHTT entraîné par la propension à l’oligomérisation de la protéine HTT expansée, car des agrégats HTT ont été identifiés dans les neurones et la glie chez les patients MH et les modèles animaux de la maladie 12,13,14,15,16,17 . Pour alimenter l’étude de la fonction et de la structure des variantes FL HTT et mHTT et fournir aux chercheurs des normes protéiques de haute qualité pour le développement de tests, un approvisionnement robuste et évolutif de protéines recombinantes homogènes est nécessaire.
En raison de sa taille (aa 1-3 144, numérotation basée sur la longueur polyQ Q23), de l’instabilité protéolytique et de sa propension à s’agréger, FL HTT s’est avéré difficile à exprimer et à isoler en tant que protéine soluble. Auparavant, la région de l’exon 1 (aa 2-90) du HTT a été exprimée et purifiée à grande échelle à l’aide de divers marqueurs qui peuvent augmenter la solubilité de la protéine dans Escherichia coli18,19,20. FL HTT a d’abord été exprimé et purifié dans un système d’expression cellulaire d’insecte utilisant le baculovirus 21,22, et des structures de microscopie électronique (EM) 30 Å à basse résolution de FL Q23-HTT et Q78-HTT réticulées chimiquement ont été signalées23. L’étude de la structure du HTT a encore progressé lorsque la production de FL Q17, Q46 et Q128-HTT avec des modifications post-traductionnelles natives (PTM) a été réalisée dans des cellules humaines utilisant des lignées cellulaires stables ou des systèmes d’expression d’adénovirus24. Ces études suggèrent que, bien que le HTT purifié existe principalement à l’état monomère, il tend également à former des oligomères et des agrégats d’ordre élevé.
L’ultracentrifugation analytique du FL Q128-HTT, avec une région polyQ fortement expansée, a permis d’obtenir plus de fractions oligomères et agrégées que la protéine avec la région polyQ non expansée24. En utilisant une lignée cellulaire stable, une stratégie a été adaptée avec succès pour stabiliser FL HTT par co-expression avec le partenaire d’interaction HAP40. Une structure cryo-EM du complexe FL HTT et HAP40 a été résolue à une résolution moyenne de 4 Å en utilisant le complexe protéique purifié (PDB:6EZ8)25. Cette stratégie de co-expression a été adaptée avec succès à un système de baculovirus, et une série de variantes HTT de haute qualité avec différentes longueurs de polyQ ont été exprimées et purifiées à partir de cellules d’insectes26. Depuis lors, d’autres structures cryo-EM du complexe de HTT avec des longueurs polyQ variables et des structures HAP40 et de résolution supérieure ont été résolues et déposées dans la base de données sur les protéines27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Nous avons optimisé une méthode de transfection et d’expression dans les cellules HEK293, en utilisant la polyéthylènemine (PEI), pour une expression transitoire rapide de FL HTT. Comme preuve de principe, les variantes FL HTT contenant 23 glutamines (FL Q23-HTT) ont d’abord été purifiées et caractérisées à l’aide d’une modification d’une méthode de purification décrite précédemment24. Cette méthode de transfection transitoire est pratique, très efficace et évolutive ; il peut produire du HTT purifié avec des rendements de 1-2 mg/L, comparables à la méthode de la lignée cellulaire stable rapportée24. Parce que la protéine est produite dans une lignée cellulaire humaine, le HTT produit est plus susceptible d’avoir des PTM humains natifs lorsqu’il est soumis à une analyse protéomique par spectrométrie de masse 11,29,30,31. Des quantités de milligrammes des variantes FL Q48-HTT, FL Q73-HTT et exon1-deleted (ΔExon1-HTT) de FL HTT ont été produites, démontrant que la méthode d’expression transitoire est particulièrement utile pour produire rapidement des variantes alternatives de HTT sans dépendre de l’effort fastidieux requis pour établir des lignées cellulaires stables pour la production.
Le protocole suivant illustre la méthode standard utilisée dans le laboratoire de ces auteurs pour la culture cellulaire, la transfection, la purification des protéines et la caractérisation des protéines post-purification pour produire FL Q23-HTT à partir d’une culture cellulaire de 2 L. Le protocole peut être étendu à des cultures plus grandes ou adapté pour purifier d’autres variantes HTT. Jusqu’à 10 L de cultures cellulaires de FL HTT et diverses mutations de site ou de troncature d’homologues HTT et HTT ont été réalisées avec succès en laboratoire en utilisant le même protocole. Le FL HTT purifié contient un pourcentage élevé de monomères ainsi que des dimères et des oligomères d’ordre supérieur. Le même profil agrégé est observé parmi les variantes produites (Q23, Q48, Q73 et Exon1 supprimé). Comme l’agrégation peut se produire lorsque les précautions appropriées ne sont pas prises, une étude de la formulation et de la stabilité au gel-dégel a été menée pour identifier les meilleures conditions pour la manipulation des protéines. Des méthodes, telles que Blue Native PAGE et SEC/MALS-RI, sont également décrites pour analyser la teneur en oligomères HTT dans le cadre du processus de contrôle de la qualité. Au profit de la communauté de recherche MH, les plasmides et les protéines HTT décrits dans cette étude sont également déposés dans le référentiel communautaire MH de l’Institut Coriell (www.coriell.org/1/CHDI).

<table><tbody><tr><td>Concentrateur 100 kDa-Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Protocole Section Number-6.2.4</td></tr><tr><td>20x blue native PAGE running buffer</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>Protocol Section Number-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Protocol Section Number-5.1</td></tr><tr><td>4x blue native PAGE sample buffer</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>Protocol Section Number-8.3</td></tr><tr><td>4x tampon de chargement LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Numéro de section de protocole-5.3</td></tr><tr><td>Fioles Erlenmeyer de 5 L Corning</td><td></td><td>431685</td><td>Numéro de section de protocole-4.2</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel d’agarose</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Numéro de section de protocole-2.2</td></tr><tr><td>Agent anti-agglomérant</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Numéro de section de protocole-4.8</td></tr><tr><td>affinité anti-FLAG M2 gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Numéro de section de protocole-6.1.1</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>Numéro de section de protocole-5.7</td></tr><tr><td>Anti-mousse-Excell anti-mousse</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>Numéro de section de protocole-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>Numéro de section de protocole-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Eaux</td><td>186006851</td><td>2,5 et micro ; m x 4,6 mm x 150 mm Protocole Numéro de section-7.3</td></tr><tr><td>bleu natif PAGE 5 % G-250 additif d’échantillon</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Numéro de section de protocole-8.3</td></tr><tr><td>carbénicilline</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Protocole Numéro de section-2.5</td></tr><tr><td>centrifugeuse - Sorvall Lynx 6000</td><td>Protocole Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>Numéro de section-6.1.3</td></tr><tr><td>Compteur de cellules - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>Numéro de section de protocole-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>Numéro de section de protocole-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Cellules E. coli compétentes-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>Numéro de section de protocole-2.4</td></tr><tr><td>digitonine</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Numéro de section de protocole-5.1</td></tr><tr><td>Détecteur d’indice de réfraction différentiel</td> Numéro de section <td>de protocole Wyatt-7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDDK peptide</td><td>Genscript</td><td></td> Service de <td>synthèse de peptides Numéro de section de protocole-6.1.4.6</td></tr><tr>Numéro de section de protocole<td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-5.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Giga Kit</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>Numéro de section de protocole-3.3</td></tr><tr><td>Eau sans endotoxine</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Numéro de section de protocole-4.1</td></tr><tr><td>kit de quantification d’endotoxines-CRL Système de détection Endosafe Nexgen-PTS</td> Charles <td>River</td><td>PTS150K</td><td>Protocole Numéro de section-3.4</td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe Rotor A23-6x100 Thermo</td><td>Fisher</td><td>75003006</td><td>Numéro de section de protocole-6.1.3</td></tr><tr><td>Logiciel FPLC - Unicorn 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>Numéro de section de protocole-6.1.4</td></tr><tr><td>Synthèse de gènes</td><td>Genscript</td><td></td><td>Service de synthèse de gènes Numéro de section du protocole : 1.2</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific : Glycérol (certifié ACS)</td> <td>G33-4</td><td>Numéro de section du protocole : 5.6</td></tr><tr><td>Milieu de croissance : milieu d’expression Expi293 : Thermo</td><td>Fisher</td><td>A1435102</td><td>: Numéro de section : 4.2</td></tr><tr><td>Cellules HEK293 : Thermo</td><td>Fisher</td><td>R79007</td><td>: Numéro de section du protocole : 4</td></tr><tr><td>cisaillement élevé homogénéisateur-Microfluidiseur</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Numéro de section Section-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Protocole Numéro de section-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>Logiciel d’analyse d’image Protocole Section Number-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>EMD</td><td>MAB2168</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td> Protocol <td>Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td>MAB5492</td><td>Protocol Section Number-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td><td>Numéro de section de protocole-5.7</td></tr><tr><td>Détecteur de diffusion de lumière multi-angle</td><td>Wyatt</td><td></td><td>Numéro de section de protocole-7.1</td></tr><tr><td>Norme de protéine non colorée</td><td>NativeMark Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Numéro de section de protocole-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Numéro de section de protocole-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Version Hi-Fi disponible Protocol Section Number-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash ; 8 % Gels d’acétate de tris</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>Numéro de section de protocole-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acétate SDS Tampon de fonctionnement</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Numéro de section de protocole-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Numéro de section de protocole-4.1</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td>Numéro de section de protocole-4.2</td></tr><tr><td>Phosphate Solution saline tamponnée (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>Numéro de section de protocole-4.5</td></tr><tr><td>Kit de minipréparation de plasmide</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Numéro de section de protocole-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>Numéro de section de protocole-2.2</td></tr><tr><td>préfabriqué Gel Bis-tris - 3-12 % NatifPAGE Novex Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>Numéro de section de protocole-8.4</td></tr><tr><td>protéase cocktail inhibiteur</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>Numéro de section Numéro-5.1</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse SEC-MALS - Astra 7</td><td>Technologie Wyatt Protocole</td><td></td><td>Numéro de section-7.6</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire -IRdye 800 CW chèvre anti-souris IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>Numéro de section de protocole-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Protocole Cytiva</td><td>90100042</td><td>Numéro de section-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>Numéro de section de protocole-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Numéro de section de protocole-6.1.1</td></tr><tr><td>Spectromètre UV - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>Numéro de section de protocole-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td> Protocole <td>de 28988951 Cytiva</td><td></td><td>Numéro de section-6.1.1</td></tr></tbody></table>

production efficace et évolutive de variantes de huntingtine humaine pleine longueur dans des cellules de mammifères à l’aide d’un système d’expression transitoire

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

La huntingtine pleine longueur (FL HTT) est une grande protéine (aa 1-3 144), exprimée de manière ubiquitaire, contenant de la polyglutamine (polyQ) avec une masse d’environ 350 kDa. Bien que la fonction cellulaire de FL HTT ne soit pas entièrement comprise, une expansion mutante du tractus polyQ au-dessus de ~36 répétitions est associée à la maladie de Huntington (MH), la longueur polyQ étant à peu près corrélée avec l’âge d’apparition. Pour mieux comprendre l’effet de la structure sur la fonction du HTT mutant (mHTT), de grandes quantités de la protéine sont nécessaires. La production submilligramme de FL HTT dans des cellules de mammifères a été réalisée en utilisant l’expression de lignées cellulaires stables inductibles par la doxycycline. Cependant, la production de protéines à partir de lignées cellulaires stables présente des limites qui peuvent être surmontées par des méthodes de transfection transitoire. 
Cet article présente une méthode robuste pour la production en faible quantité de milligrammes de FL HTT et de ses variantes à partir de plasmides optimisés pour le codon par transfection transitoire à l’aide de polyéthylènemine (PEI). La méthode est évolutive (>10 mg) et donne constamment 1 à 2 mg/L de culture cellulaire de FL HTT hautement purifié. Conformément aux rapports précédents, l’état de la solution purifiée de FL HTT s’est avéré très dynamique; La protéine a une propension à former des dimères et des oligomères d’ordre élevé. Une clé pour ralentir la formation d’oligomères est de travailler rapidement pour isoler les fractions monomères des fractions dimériques et oligomères d’ordre élevé pendant la chromatographie d’exclusion de taille. 
La chromatographie d’exclusion de taille avec diffusion de la lumière multiangle (SEC-MALS) a été utilisée pour analyser le dimère et la teneur oligomérique d’ordre supérieur du HTT purifié. Aucune corrélation n’a été observée entre la longueur du polyQ FL HTT (Q23, Q48 et Q73) et la teneur en oligomères. La construction exon1-supprimée (aa 91-3,144) a montré une propension à l’oligomérisation comparable à FL HTT (aa 1-3,144). Les méthodes de production, de purification et de caractérisation par indice de réfraction SEC/MALS (IR), électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE), Western blot, Native PAGE et Blue Native PAGE sont décrites ici.

Nous fournissons des protocoles évolutifs couvrant la conception de construction, la transfection transitoire, l’expression et la purification de variantes complètes de la protéine huntingtine humaine dans les cellules HEK293.

Production efficace et évolutive de variantes de huntingtine humaine pleine longueur dans des cellules de mammifères à l’aide d’un système d’expression transitoire

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Le protocole a été développé pour la production de variantes de huntingin pleine longueur à une échelle de faible milligramme. Il permet d’obtenir des protéines constantes de haute qualité essentielles pour les chercheurs MH. La démonstration de la procédure sera Michael Harris, un chercheur scientifique du laboratoire Curia.Commencez par ajouter un gramme de polyéthylèneimine 25 K à un litre d’eau exempte d’endotoxines, et remuez bien. Ajuster le pH à 2,0 en utilisant de l’acide chlorhydrique 100 millimolaires et remuer jusqu’à ce que tout le polyéthylèneimine se dissolve. Ajustez ensuite le pH à 7,0 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium de 100 millimolaires et passez la solution à travers un filtre de 0,2 micromètre.Faites des aliquotes de la solution filtrée et conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Propager les cellules HEK293 dans le milieu de croissance supplémenté en streptomycine pénicilline dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, 90 RPM, 5% de dioxyde de carbone pendant 18 à 24 heures. Un jour avant la transfection, diluer les cellules à une densité d’environ 1,2 x 10 à la sixième cellule de puissance par millilitre dans deux litres de milieu de croissance dans un erlenmeyer de cinq litres et incuber pendant 18 à 24 heures.À la fin de l’incubation, mesurer la densité et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules en suivant les instructions du fabricant. Après avoir calculé la quantité de polyéthylèneimine et de plasmide nécessaire à la transfection, diluer la polyéthylèneimine et le plasmide individuellement dans 100 millilitres de PBS et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, mélangez le plasmide dilué et la polyéthylèneimine en remuant doucement et incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes.Ajouter le mélange à la culture cellulaire et mélanger en remuant doucement. Maintenant, laissez les cellules se développer pendant 24 heures. Le lendemain, ajouter une solution de butyrate de sodium à une concentration finale d’agent antiagglomérant et antimousseux à deux millimolaires au rapport volumique de 1:1 000 à la culture et incuber les cellules dans l’incubateur humidifié pendant 48 heures.Après avoir mesuré la viabilité et la densité cellulaires, récoltez les cellules par centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes et stockez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius avant la purification. Pour la purification anti-FLAG à l’aide de FPLC, emballer 12 à 25 millilitres de résine anti-FLAG sur une colonne vide à un débit de quatre millilitres par minute en utilisant le tampon A et ajuster la hauteur du piston pour supprimer l’espace entre l’extrémité du piston et le lit de résine. Ensuite, suspendez la pastille de cellule décongelée dans un tampon de lyse froide et passez la suspension de la cellule une fois à travers un homogénéisateur à cisaillement élevé à une pression de 1 000 livres par pouce carré.À l’aide d’une centrifugeuse équipée d’un rotor compatible à angle fixe, clarifier le lysat à 20 000 G pendant une heure. Programmez FPLC sous la fenêtre Méthode, chargez le lysat clarifié via la pompe à échantillon et lavez la colonne avec les volumes de colonne souhaités de tampon A, B, C, D et tampon d’élution comme décrit dans le manuscrit texte. Une fois l’exécution terminée, analysez 10 microlitres des fractions de pic à l’aide de SDS-PAGE.Combinez les fractions de pic avec la pureté souhaitée et économisez environ 50 microlitres des éluats combinés pour une analyse plus approfondie SDS-PAGE. Commencez à équilibrer la colonne SEC à l’aide du FPLC et chargez l’éluat anti-FLAG via une superboucle de 50 millilitres. Après avoir exécuté la mémoire tampon SEC, laissez la séparation SEC se produire pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Comparez le profil d’élution avec le profil d’élution HTT standard pour distinguer les pics monomères, dimères et oligomères d’ordre supérieur. Regrouper les fractions HTT monomères en fonction du profil d’élution de la colonne SEC et, si vous le souhaitez, regrouper séparément les fractions HTT oligomères et dimériques d’ordre supérieur. Concentrer la protéine HTT accumulée à l’aide d’un concentrateur centrifuge de 100 kilodaltons à quatre degrés Celsius.Après calcul de la concentration en protéines, aliquote inférieure à 100 microlitres de la protéine HTT purifiée dans un tube microcentrifuge cryo-sûr. Congelez rapidement les aliquotes à l’aide d’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Effectuer toutes les analyses SEC-MALS à quatre degrés Celsius sur le système HPLC, couplé à un détecteur UV, un détecteur de diffusion de lumière multi-angle, un détecteur d’indice de réfraction différentiel, et utiliser 0,185 comme incrément d’indice de réfraction pour HTT.Purgez la pompe et les détecteurs avec de l’eau filtrée de qualité CLHP et connectez la colonne UHPLC au système. Équilibrez la colonne avec de l’eau filtrée, puis un tampon SEC-MALS jusqu’à ce que tous les signaux du détecteur atteignent la ligne de base. Injecter deux microlitres de solution BSA à un débit de 0,3 millilitre par minute pendant 15 minutes par injection.Inspectez la qualité des données, effectuez la normalisation, l’alignement des pics et la correction de l’élargissement de la bande en fonction du profil BSA, et créez un modèle pour les exemples HTT suivants. Décongeler rapidement un flacon de l’échantillon FL Q23-HTT dans un bain-marie à température ambiante à l’aide d’un flotteur. Filtrez le HTT à travers un filtre de rotation de 0,1 micromètre.Injectez deux à quatre microlitres de l’échantillon HTT et faites fonctionner pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius à un débit de 0,3 millilitre par minute. Analysez les données chromatographiques et de diffusion de la lumière à l’aide du logiciel d’accompagnement et générez un diagramme de Zimm pour déterminer la masse moléculaire moyenne en poids pour chaque pic. Dans la présente étude, en utilisant un procédé de colonne en deux étapes, plus de 95% de pureté a été obtenue pour HTT et le principal contaminant était le chaperon Hsp70, qui a été éliminé par un lavage intensif avec du chlorure de magnésium et de l’ATP pendant l’étape de purification d’affinité anti-FLAG La surexpression de FL HTT peut entraîner une fragmentation de la protéine, mais FL Q23-HTT produit par la méthode résolue comme une seule bande avec le poids moléculaire correct de 350 kilodaltons indique qu’il n’y a pas fragmentation.L’analyse par transfert Western après la réaction des anticorps avec FL Q23-HTT a démontré que la protéine était isolée sans troncature détectable significative, car aucune bande supplémentaire liée aux fragments n’a été observée. La variance de longueur poly-Q FL HTT, Q23, Q48 et Q73 a réagi comme prévu dans le transfert Western, montrant un signal progressivement plus fort pour l’anticorps monoclonal dirigé poly-Q MW1, corrélé à l’augmentation de la longueur Q. Parmi les colonnes HPLC testées, la colonne SEC a montré une résolution suffisante entre le monomère HTT et le dimère, de sorte que les masses molaires pouvaient être distinguées.Le FL HTT purifié de la SEC a montré plusieurs bandes correspondant aux états d’oligomérisation, ce qui pourrait être dû à la présence de plusieurs plaques hydrophobes qui contribuent à la formation d’oligomères d’ordre supérieur pendant la migration dans le gel. Le HTT purifié a montré trois bandes principales sur le PAGE natif bleu avec un poids moléculaire estimé à 643, 927 et 1 070 kilodaltons qui représentent probablement les espèces monomères, dimériques et trimères de HTT, respectivement. Une manipulation appropriée de la huntingtine purifiée est essentielle pour éviter de générer des oligomères de haut ordre dans les agrégats solubles.Il est impératif que l’utilisateur final travaille rapidement pour distribuer l’échantillon dans des tubes pré-refroidis avant la congélation instantanée. Les tests de stabilité à long terme peuvent être effectués sur des échantillons stockés à des périodes prolongées à moins 80 degrés Celsius. Des analyses HPLC SEC-MALS répéteront confirmer s’il y a eu un changement dans la teneur en monomères de l’échantillon.

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Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Nous présentons ici un protocole robuste et optimisé pour la production de quantités de milligramme de monomères natives, tag-free et les fibrilles de l’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO).

Génération d’indigène, non balisés la huntingtine Exon1 monomère et de fibrilles en utilisant une stratégie de Fusion de SUMO

La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

Le BDNF recombinant contenant une séquence Avi (BDNFAvi) est produit dans les cellules HEK293 d’une manière rentable et est purifié par la chromatographie d’affinité. BDNFavi est alors directement mono-biotinylé avec l’enzyme BirA dans un tube. BDNFavi et BDNFavi mono-biotinylés conservent leur activité biologique par rapport au BDNF disponible dans le commerce.

Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Découvrez une méthode efficace pour produire des variantes de huntingtine pleine longueur dans des cellules HEK293. Ce protocole garantit une pureté supérieure à 95 % et facilite la recherche sur la maladie de Huntington.

Production efficace et évolutive de variantes de huntingtine humaine pleine longueur dans des cellules de mammifères à l’aide d’un système d’expression transitoire (Vidéo) | JoVE Journal

Production efficace et évolutive de variantes de huntingtine humaine pleine longueur dans des cellules de mammifères à l’aide d’un système d’expression transitoire

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