Name: Constructie van homozygote mutanten van trekkende sprinkhanen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer CRISPR/Cas9-methoden voor het construeren van homozygote sprinkhaanmutanten met embryo-cryopreservatie. Dit protocol versnelt genetisch onderzoek naar insectenbiologie en plaagbeheer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 en de China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).

1. Selectie van doellocaties en sgRNA-ontwerp
<ol><li>Verzamel zoveel mogelijk sequentie-informatie voor het gen van belang door middel van literatuuronderzoek en/of het zoeken naar de mRNA of coderende DNA-sequentie (CDS) van het gen bij NCBI en sprinkhanendatabase24.</li>
	<li>Vergelijk de sequentie van het geïnteresseerde gen met zijn genomische DNA-sequentie om de exon- en intronregio's te onderscheiden.</li>
	<li>Selecteer een kandidaatregio voor het ontwerp van de doelsite op basis van het onderzoeksdoel. Ontwerp primerparen om het fragment van het kandidaat-gebied te versterken en de wild-type sequentie te verifiëren door sequencinganalyse van het PCR-product. OPMERKING: Er zijn verschillende strategieën voor de selectie van de kandidaat-doelregio. Gebruik bijvoorbeeld in het meeste gen/ eiwitfunctieonderzoek het exonfragment dicht bij het begincodon als het kandidaat-gebied om ervoor te zorgen dat de hele eiwit / RNA-functie verloren gaat na de genoombewerking (d.w.z. gen knock-out). Terwijl voor de functieanalyse van een specifiek domein, selecteert u de kandidaatregio aan het begin (of beide uiteinden) van het domein.</li>
	<li>Gebruik online bronnen zoals de E-CRISPDesign 25 om te zoeken naar potentiële doelsites in de doelregio van de kandidaat.<ol><li>Selecteer "Drosophila melanogaster BDGP6" (of een ander insect) in de vervolgkeuzelijst met referentiegenomen en kies "Input is FASTA-sequentie" gevolgd door het plakken van de sequentie van het doelgebied in het tekstvak (in FASTA-indeling).</li>
		<li>Start de applicatie door op "Start sgRNA search" te drukken met "medium" en "single design" om de mogelijke doelsites te krijgen. Selecteer 1-3 potentiële doelen uit de resultaten op basis van hun voorspelde scores en ontwerp de bijbehorende sgRNA's dienovereenkomstig. OPMERKING: Er zijn veel meer online platforms voor CRISPR-ontwerp, zoals CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, enzovoort (zie materiaaltabel). Sommigen van hen hebben de functie van specificiteitscontrole voor de soorten waarvan de genomische sequentiegegevens zich in hun databases bevinden. De genomische sequentie van sprinkhanen is echter op geen enkele online website gevonden. Het is beter om meer dan één online tool te gebruiken voor het CRISPR-ontwerp bij sprinkhanen. Overweeg uitgebreid de resultaten van verschillende websites en selecteer het sgRNA uit de resultaten op basis van het principe van de hoogste specificiteit, de hoogste efficiëntie en de minste mismatch-snelheid (figuur 1A, B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Synthese en verificatie van het sgRNA in vitro
<ol><li>Synthetiseer het sgRNA met behulp van sgRNA-synthesekits volgens de handleiding van de fabrikant (Tabel met materialen). Deze procedure omvat meestal drie stappen: DNA-sjabloonamplificatie, in vitro transcriptie en sgRNA-zuivering21. Verdun het gesynthetiseerde sgRNA met nucleasevrij water tot een opslagconcentratie van 300 ng/μL voor verder gebruik.</li>
	<li>Amplify en zuiver het doelgenfragment om te dienen als substraat van de in vitro splitsingstest van het CRISPR/Cas9-systeem. Voer deze stappen uit volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Verdun het gekochte Cas9-eiwit tot 300 ng / μL met nucleasevrij water. Incubeer 1 μl sgRNA (300 ng/μl) en 1 μl Cas9-eiwit (300 ng/μl) met 200 ng gezuiverd doelfragment in de splitsingsbuffer bij 37 °C gedurende 1 uur (10 μl totaal volume; zie tabel 1). Schat de efficiëntie van sgRNA geïnduceerde Cas9-splitsing door agarosegel-elektroforese (figuur 1C). Selecteer de sgRNA's met hoge activiteit voor de volgende micro-injectie. OPMERKING: De resultaten van agarosegel-elektroforese kunnen worden omgezet in grijswaardenafbeeldingen met beeldverwerkingssoftware en de splitsingsefficiëntie wordt geschat op basis van de grijswaarden van de banden van gespeculeerde groottes.</li>
</ol>3. Micro-injectie en kweek van de eieren
<ol><li>Bereid de injectienaalden voor door glazen haarvaten te trekken met een micropipettrekker (Table of Materials). Stel de parameters als volgt in: Warmte op 588, Trek op 90, Snelheid op 60 en Tijd op 40. Maal de punt van de injectienaald met een micromolen (Table of Materials). OPMERKING: Ideale naaldpunten zijn open en scherp (figuur 2A). Het wordt ten zeerste aanbevolen om extra naalden voor de experimenten voor te bereiden, omdat naalden soms worden geblokkeerd of per ongeluk worden gebroken tijdens injecties.</li>
	<li>Meng 1 μL Cas9-eiwit (300 ng/μL) met 1 μL van het geverifieerde sgRNA (300 ng/μL) samen om de RNP's voor injectie te verkrijgen. Voeg 8 μL RNase-vrij steriel water toe om het uiteindelijke volume van het mengsel te maken tot 10 μL. Meng de oplossing grondig en houd deze op ijs. OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van het Cas9-eiwit en sgRNA's kunnen worden geoptimaliseerd op basis van de bewerkingsresultaten. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien van de bereide RNP-oplossing en onmiddellijk gebruik wordt aanbevolen.</li>
	<li>Kweek de mannelijke en vrouwelijke volwassen sprinkhanen samen bij 30 °C met een 16 (licht):8 (donkere) fotoperiode en geef ze voldoende verse tarwezaailingen als voedsel. Observeer deze sprinkhanen dagelijks en zet een ovipositiepot (een plastic bloempot of beker gevuld met nat steriel zand) in de opfokkooi voor ovipositie zodra de sprinkhanen paren. OPMERKING: Gewoonlijk zijn 100 paar volwassen sprinkhanen die in een opfokkooi worden grootgebracht (40 cm x 40 cm x 40 cm) voldoende om eieren te genereren voor het uitschakelen van een enkel gen. Kweek extra sprinkhanenparen als er meer eieren nodig zijn.</li>
	<li>Verzamel de vers gelegde eidozen uit de ovipositiepot en wacht ongeveer 30 minuten voor het looien van de eieren. Isoleer de eieren voorzichtig van de eidozen in water met een fijne borstel en was ze drie keer met steriel water. Bewaar de eieren in een petrischaaltje en voeg steriel water toe om ze vochtig te houden. OPMERKING: Het looien van de nieuw gelegde eieren kan de mutantenefficiëntie aanzienlijk verbeteren21.</li>
	<li>Vul een injectienaald met de bereide RNP-oplossing en laad deze in de micromanipulator (Tabel met materialen).<ol><li>Stel de microinjectieparameters als volgt in: 300 hPa van de injectiedruk (pi), 0,5 s van de injectietijd (ti) en 25 hPa van de compensatiedruk (pc).</li>
		<li>Druk op het pedaal om het volume van de geïnjecteerde oplossing te evalueren. Pas de injectiedruk en injectietijd aan om ervoor te zorgen dat het injectievolume ongeveer 50-100 nL is. OPMERKING: Zuig de resterende lucht in de naald af om de injectieoplossing zoveel mogelijk continu en controleerbaar te maken. De verbinding van de naald en de micromanipulator moet strak zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Schik de steriele eieren regelmatig op het injectiekussen (figuur 2B,C) en plaats het kussen op de objecttafel van de microscoop (figuur 3A). Pas de vergroting van de microscoop aan totdat de eieren worden waargenomen. Stel de micro-injectienaald onder de microscoop in totdat de injectiepunt zichtbaar is en plaats deze in de buurt van het te injecteren ei.</li>
	<li>Start de injectie op een geschikte hoogte en een hoek van 30-45 graden. Steek de punt voorzichtig in het ei in de buurt van de micropyles van het ei (figuur 3B) en druk op het pedaal om de injectie te voltooien. Trek de naald snel in en beweeg het injectiekussen voor injectie van het volgende ei. OPMERKING: Een lichte uitzetting van het ei tijdens de micro-injectie moet worden waargenomen. Een kleine hoeveelheid cytoplasmatische lekkage bij het gaatje is acceptabel. Vervang de injectienaald door een nieuwe of pas de injectiehoek aan als de uitstroom van vloeistof te veel is.</li>
	<li>Breng de geïnjecteerde eieren over in een kweekschaal (een petrischaaltje met een stuk vochtig filtreerpapier) en plaats ze in een broedmachine bij 30 °C. OPMERKING: Het duurt ongeveer 13-14 dagen voordat nimfen uit deze geïnjecteerde eieren komen (op voorwaarde dat mutatie van het doelgen de ontwikkeling van de embryo's niet beïnvloedt) (figuur 3C). Injecteer ten minste 100 eieren om ervoor te zorgen dat er voldoende broed- en eclosiehoeveelheden zijn om een specifiek gen uit te schakelen.</li>
</ol>4. Schatting van de mutatiesnelheid en screening van mutanten
<ol><li>Controleer de ontwikkeling van de geïnjecteerde eieren elke dag na de injectie. Breng geïnjecteerde eieren over naar een nieuwe kweekschaal om de 24 uur in de eerste 5 dagen.</li>
	<li>Op de 6edag ( of later) na injectie, willekeurig 10 eieren plukken en overbrengen in een buis en de eieren adequaat malen met twee stalen ballen op 60 Hz gedurende 6 minuten met behulp van een molen (zie tabel met materialen). Resuspendeer het puin met 1 ml PBS. Breng 5 μL van het mengsel over in 45 μL van 50 mM NaOH en lyseer gedurende 5 minuten bij 95 °C. Voeg 5 μL 1 M Tris-HCl (pH=8,0) toe aan het lysissysteem om de alkalische lysisreactie te beëindigen. OPMERKING: Eieren kunnen op elke dag na de laatste overdracht worden uitgezocht voor alkalische lyse en meerdere eieren kunnen als één monster worden gebruikt, afhankelijk van hun ontwikkelingssituatie (bijvoorbeeld vijf embryo's van 6 dagen oud kunnen als één monster worden gebruikt en twee embryo's van 10 dagen oud kunnen als één monster worden gebruikt). Soms is het niet haalbaar om het genomische DNA van eieren te krijgen met behulp van de alkalische lysismethode. Commerciële genomische DNA-extractiekits kunnen worden gebruikt als een alternatieve methode voor het isoleren van het genomische DNA uit de eieren.</li>
	<li>Neem 1 μL van het lysisproduct als PCR-sjabloon om het doelgenfragment te versterken (tabel 2 en tabel 3) en stuur de PCR-producten voor sequencing. Vergelijk de sequencingresultaten met de wild-type sequentie om voorlopig te evalueren of het CRISPR/Cas9-systeem het doelgen in vivo heeft gesplitst (figuur 4A). Laat de rest van de eieren voor verdere ontwikkeling op voorwaarde dat indels worden gedetecteerd in het embryonale stadium. OPMERKING: Op deze manier kan de mutatiesnelheid voorlopig worden geschat in het embryostadium. Als er bij deze stap geen indels worden gevonden, bereidt u enkele nieuwe sgRNA's voor het doelgen voor en herhaalt u het knock-outprotocol uit stap 2.1.</li>
	<li>Breng de uitgekomen nimfen over naar een opfokkooi en kweek ze zoals beschreven in stap 3.3. Wanneer de nimfen zich ontwikkelden tot het vijfde instarstadium, scheid ze dan met plastic kweekbekers (1 nimf / beker). OPMERKING: Het duurt meestal ongeveer 25-35 dagen voordat de nimfen zich ontwikkelen tot hun vijfde instar en het meest voor de hand liggende fenotype is dat de vleugelknoppen zich uitstrekken tot de vierde of vijfde buiksegmenten. Bovendien wordt aanbevolen om de fenotypen van dode nimfen vast te leggen om de relatie tussen het doelgen en fenotypen in verder onderzoek te voorspellen.</li>
	<li>Knip ongeveer 2 mm lengte van de antennes af met een ontleedschaar en lyseer deze met behulp van de alkalische lysismethode (stap 4.2). Analyseer de doelgenfragmentsequentie van deze nimfen zoals hierboven beschreven (stap 4.3) om de G0-mutanten te identificeren (figuur 4B). OPMERKING: De antennes die voor lysis worden gesneden, kunnen iets langer zijn en het slijpen of hakken van de antennes is nuttig voor lysis, hoewel de antennes direct kunnen worden verteerd. Individuen met meerdere pieken in de buurt van de doellocatie in het sequencingresultaat worden geïdentificeerd als positieve mutanten en toegestaan voor latere ontwikkeling en paring.</li>
</ol>5. Vestiging en doorgifte van mutantenlijnen
<ol><li>Voer kruisingen uit met behulp van de G 0-mutanten en wild-type sprinkhanen (figuur 4B). Verzamel de oöcysten en incuber deze afzonderlijk bij 30 °C. Gebruik 3-6 ontwikkelde eieren in elke oöcyst om mutaties te detecteren zoals beschreven in stap 4.2 en 4.3. Bewaar mutatie-positieve oöcysten voor de volgende ontwikkeling en verlaat de mutatie-negatieve oöcysten. OPMERKING: Schatting van de mutatiesnelheid in het embryonale stadium kan de screening vanG-1-mutanten aanzienlijk versnellen. Meestal kunnen 3-6 ontwikkelde eieren worden gemengd als één monster voor PCR-gemedieerde genotypering zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Achter de G1 nimfen zoals beschreven in stap 4.4. Snijd ongeveer 2 mm lengte van de antennes af om PCR-gebaseerde genotypering uit te voeren zoals beschreven in stap 4.5 voor het detecteren van G 1-heterozygoten. Voer TA-klonen uit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) om hun mutaties te identificeren. Voer in-cross uit met G 1-heterozygoten met dezelfde mutaties om G2-nimfen te verkrijgen. OPMERKING: Sanger-sequencing van de PCR-producten kan alleen informatie opleveren voor het achterhalen van de heterozygoten, maar niet genoeg informatie voor het identificeren van de exacte mutaties. Ta-klonen met behulp van de PCR-producten is dus vereist om de mutaties duidelijk te identificeren en kan de oprichting van stabiele mutantlijnen bevorderen.</li>
	<li>Fok de G2 nimfen tot hun vijfde instar. Gebruik de PCR-gebaseerde genotypering beschreven in stap 5.2 om de homozygoten en/of heterozygoten te identificeren die geschikt zijn voor verder onderzoek en stabiele passaging (figuur 4B). OPMERKING: Let op het vermijden van vermenging van homozygoten en heterozygoten. Het wordt aanbevolen om pcr-gebaseerde genotypering uit te voeren in elke generatie om de homozygositeit en / of heterozygositeit van elke populatie te bevestigen. Het aantal sprinkhanen dat voor deze controle wordt gebruikt, is afhankelijk van de populatiegrootte. Bovendien kan de populatie sprinkhanen worden uitgebreid door de in-cross-strategie.</li>
</ol>6. Cryopreservatie en reanimatie van eieren
<ol><li>Was de te cryopreserveren eieren met steriel water en incubeer ze in een kweekschaal zoals hierboven beschreven (stap 3.8) gedurende 5-6 dagen. Verzamel deze eieren samen in de kweekschaal en bedek ze met fragmenten van filterpapier. Wikkel het hele kweekgerecht in met een paraffinefilm.</li>
	<li>Houd de schaal 2 dagen op 25 °C, gevolgd door nog eens 2 dagen op een relatief lagere temperatuur (13-16 °C). Zet de schaal vervolgens over in een koelkast van 6 °C. Voeg er elke 2 weken water aan toe om de eieren een vochtige omgeving te bieden (figuur 5A). OPMERKING: Er wordt gespeculeerd dat de embryo's zich in het katatrepsisstadium bevinden nadat ze gedurende 5-6 dagen zijn ontwikkeld bij 30 °C26. Gradiëntkoeling is nuttig voor cryopreservatie van eieren (tabel 5).</li>
	<li>Voor het reanimeren van de gecryopreserveerde eieren haal je de petrischaal uit de koelkast en bewaar je hem 2 dagen op 25 °C. Leg deze eieren in een broedmachine van 30 °C totdat de nimfen uitkomen (figuur 5B). OPMERKING: Het is noodzakelijk om de gecryopreserveerde eieren bij 25 °C te plaatsen voordat ze naar een broedmachine van 30 °C worden overgebracht. De embryo's kunnen gedurende ten minste vijf maanden worden gecryopreserveerd, hoewel de uitkomstsnelheid en eclosiesnelheid kunnen afnemen vanwege de cryopreservatie (tabel 5).</li>
</ol>

<ol><li>Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of therapeutic genome editing.</a> Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).</li>
<li>van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delivery+challenge%3A+fulfilling+the+promise+of+therapeutic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).</li>
<li>McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+CRISPR+technologies+for+gene+editing+and+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation.</a> Nature Communications. 11 (1), 1281(2020).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+systems+in+genome+editing%3A+Methodologies+and+tools+for+sgRNA+design%2C+off-target+evaluation%2C+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+editing%3A+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li>
<li>Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+iap+gene%2C+responsible+for+alkaline+phosphatase+isozyme+conversion+in+Escherichia+coli%2C+and+identification+of+the+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.</a> Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).</li>
<li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+microinjection+and+knockout+mutant+identification+of+CRISPR%2FCas9+genome-edited+Helicoverpa+Armigera+%28Hubner%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE1%22%5BJournal%5D)">Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068(2021).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+knockout+of+the+abdominal-A+homeotic+gene+in+the+global+pest%2C+diamondback+moth+%28Plutella+xylostella%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).</li>
<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+and+efficient+CRISPR%2FCas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+locusts%3A+Successful+establishment+of+an+olfactory+deficiency+line+by+targeting+the+mutagenesis+of+an+odorant+receptor+co-receptor+%28Orco%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BmHpo+mutation+induces+smaller+body+size+and+late+stage+larval+lethality+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+induces+exon+skipping+by+complete+or+stochastic+altering+splicing+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), 60(2018).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+tanning+improves+the+efficiency+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutant+locust+production+by+enhancing+defense+ability+after+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Vinylanisole+is+an+aggregation+pheromone+in+locusts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts.</a> Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).</li>
<li>Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locust+and+grasshopper+management%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Locust and grasshopper management.</a> Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).</li>
<li>Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.locustmine.org:8080/locustmine">http://www.locustmine.org:8080/locustmine</a> (2019).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.e-crisp.org/E-CRISP/">http://www.e-crisp.org/E-CRISP/</a> (2014).</li>
<li>Pétavy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+development+of+the+vitellophags+during+embryogenesis+of+the+migratory+locust%2C+Locusta+migratoria+L.+%28Orthoptera+%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Insect+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae).</a> International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).</li>
<li>Barry, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injecting+Gryllus+bimaculatus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Injecting Gryllus bimaculatus eggs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726(2019).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).</li>
<li>Du, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Laccase+2+severely+impairs+cuticle+tanning+and+pathogen+resistance+during+the+pupal+metamorphosis+of+Anopheles+sinensis+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae).</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 171(2017).</li>
<li>Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tanning+of+grasshopper+eggs+by+an+exocrine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion.</a> Science. 152 (3718), 95-97 (1966).</li>
<li>Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularization+in+locust+embryos+occurs+before+blastoderm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation.</a> Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactive+effect+of+photoperiod+and+temperature+on+the+induction+and+termination+of+embryonic+diapause+in+the+migratory+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Managment+Science%22%5BJournal%5D)">Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust.</a> Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).</li>
<li>Jarwar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomic+analysis+reveals+molecular+profiles+of+central+nervous+system+in+maternal+diapause+induction+of+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22G3-Genes+Genomes+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Sprinkhanen behoren tot de meest verwoestende plagen voor de landbouw sinds de beschaving van de mens23. CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerkingstechnologie is een krachtig hulpmiddel voor een betere kennis van de biologische mechanismen bij sprinkhanen en een veelbelovende ongediertebestrijdingsstrategie. Het is dus van groot voordeel om een efficiënte en eenvoudig te gebruiken methode van CRISPR / Cas9-gemedieerde constructie van homozygote sprinkhanenmutanten te ontwikkelen. Hoewel er enkele gew...

Genbewerkingstechnologieën kunnen worden gebruikt om inserties of deleties in een specifieke genoomlocus te introduceren om het doelgen met doel1 kunstmatig te wijzigen. In de afgelopen jaren heeft de CRISPR/Cas9-technologie zich snel ontwikkeld en heeft een groeiend toepassingsgebied in verschillende gebieden van life sciences 2,3,4,5,6. Het CRISPR/Cas9-systeem werd in 1987 ontdekt7 en wordt op grote schaal aangetroffen in bacteriën en archaea. Verder onderzoek wees uit dat het een prokaryote adaptieve immuunsysteem was dat afhankelijk is van het RNA-geleide nuclease Cas9 om fagen8 te bestrijden. Het kunstmatig gemodificeerde CRISPR/Cas9-systeem bestaat voornamelijk uit twee componenten, een enkel gids-RNA (sgRNA) en het Cas9-eiwit. Het sgRNA bestaat uit een CRISPR-RNA (crRNA) complementair aan de doelsequentie en een aanvullend trans-activerend crRNA (tracrRNA), dat relatief geconserveerd is. Wanneer het CRISPR/Cas9-systeem wordt geactiveerd, vormt het sgRNA een ribonucleoproteïne (RNP) met het Cas9-eiwit en leidt Cas9 naar zijn doellocatie via de baseparing van RNA-DNA-interacties. Vervolgens kan het dubbelstrengs-DNA worden gesplitst door het Cas9-eiwit en als gevolg daarvan ontstaat de dubbelstrengsbreuk (DSB) in de buurt van het protospacer-aangrenzende motief (PAM) van de doellocatie 9,10,11,12. Om de schade veroorzaakt door de DSB's te beperken, zouden cellen uitgebreide DNA-schadereacties activeren om de genomische schade efficiënt te detecteren en de reparatieprocedure te starten. Er zijn twee verschillende reparatiemechanismen in de cel: niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologiegerichte reparatie (HDR). NHEJ is de meest voorkomende reparatieroute die DNA-dubbelstrengsbreuken snel kan repareren en celapoptose kan voorkomen. Het is echter foutgevoelig vanwege het achterlaten van kleine fragmenten van inserties en deleties (indels) in de buurt van de DSB's, wat meestal resulteert in een open leesframeverschuiving en dus kan leiden tot gen knock-out. Homologe reparatie is daarentegen een vrij zeldzame gebeurtenis. Op voorwaarde dat er een reparatiesjabloon is met sequenties die homoloog zijn aan de context van de DSB, zouden cellen af en toe de genomische breuk repareren volgens het nabijgelegen sjabloon. Het resultaat van HDR is dat de DSB nauwkeurig wordt gerepareerd. Vooral als er een extra sequentie is tussen de homologe sequenties in de sjabloon, zouden ze via HDR in het genoom worden geïntegreerd en op deze manier kunnen de specifieke geninvoegingen worden gerealiseerd13.
Met de optimalisatie en ontwikkeling van de sgRNA-structuren en Cas9-eiwitvarianten is het op CRISPR/Cas9 gebaseerde genetische bewerkingssysteem ook met succes toegepast in onderzoek naar insecten, waaronder maar niet beperkt tot Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella en Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Voor zover de auteurs weten, hoewel RNP's bestaande uit het Cas9-eiwit en in vitro getranscribeerd sgRNA zijn gebruikt voor sprinkhanengenoombewerking20,21,22, ontbreekt nog steeds een systematisch en gedetailleerd protocol voor CRISPR / Cas9 ribonuclease gemedieerde constructie van homozygote mutanten van de migrerende sprinkhaan.
De migrerende sprinkhaan is een belangrijke landbouwplaag die een wereldwijde verspreiding heeft en een aanzienlijke bedreiging vormt voor de voedselproductie, vooral schadelijk voor gramineachtige planten, zoals tarwe, maïs, rijst en gierst23. Genfunctieanalyse op basis van genoombewerkingstechnologieën kan nieuwe doelen en nieuwe strategieën bieden voor de bestrijding van migrerende sprinkhanen. Deze studie stelt een gedetailleerde methode voor voor het uitschakelen van migrerende sprinkhanengenen via het CRISPR/Cas9-systeem, inclusief de selectie van doellocaties en het ontwerp van sgRNA's, in vitro synthese en verificatie van de sgRNA's, micro-injectie en kweek van eieren, schatting van de mutatiesnelheid in het embryonale stadium, detectie van mutanten en passage en behoud van de mutanten. Dit protocol kan worden gebruikt als een basale referentie voor manipulatie van de overgrote meerderheid van sprinkhanengenen en kan waardevolle referenties bieden voor genoombewerking van andere insecten.

<table><tbody><tr><td>10&times;NEBuffer r3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7030S</td><td>De buffer van &nbsp;in vitro Cas9 splitsing assays</td></tr><tr><td>2xEs Taq MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0690</td><td>Voor genamplificatie</td></tr><tr><td>2xPfu MasterMix (Dye)</td><td>Cwbio</td><td>CW0686</td><td>Voor genamplificatie</td></tr><tr><td>CHOPCHOP</td><td></td><td></td><td>Online website voor het ontwerpen van sgRNA's, http://chopchop.cbu.uib.no/.</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>Online website voor het ontwerpen van sgRNA's, http://crispor.org.</td></tr><tr><td>CRISPRdirect</td><td></td><td></td><td>Online website voor het ontwerpen van sgRNA's, http://crispr.dbcls.jp/.</td></tr><tr><td>Elektroforese voeding</td><td>LIUYI BIOLOGY</td><td>DYY-6D</td><td>Scheiding van nucleïnezuurmoleculen van verschillende grootte</td></tr><tr><td>Eppendorf buis</td><td>Eppendorf</td><td>30125177</td><td>Voor monsterverzameling, enz.</td></tr><tr><td>Fijne borstels</td><td>Annigoni</td><td>1235</td><td>Voor het schoonmaken en isoleren van eieren. Online gekocht.</td></tr><tr><td>Flaming/bruin micropipettrekker</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td>Voor het maken van de micro-injectienaalden</td></tr><tr><td>Gel Extractie Kit</td><td>Cwbio</td><td>CW2302</td><td>DNA herstel en zuivering</td></tr><tr><td>Gel Imaging Analyse Systeem</td><td>OLYMPUS</td><td>Gel Doc XR</td><td>Bekijk de elektroforese resultaten</td></tr><tr><td>GeneTouch Plus</td><td>Bioer</td><td>B-48DA</td><td>Voor genamplificatie</td></tr><tr><td>Glas elektrode capillair</td><td>Gairdner</td><td>GD-102</td><td>Voor het maken&nbsp;injectienaalden met&nbsp;een&nbsp;micropipet Puller</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>MEMMERT</td><td>INplus55</td><td>Voor treksprinkhaan embryocultuur</td></tr><tr><td>Metaalbad</td><td>TIANGEN</td><td>AJ-800</td><td>Voor het verwarmen van het monster</td></tr><tr><td>Micro auto-injector</td><td>Eppendorf</td><td>5253000068</td><td>Micro-injectie van embryo's vroeg in de ontwikkeling</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Allsheng</td><td>MTV-1</td><td>Gebruikt voor het mengen van reagentia</td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td>Om de punt van de injectienaald te slijpen</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Voor het laden van oplossingen in de injectienaalden.</td></tr><tr><td>Micromanipulatie systeem</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td>Een alternatief manipulatiesysteem voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>cnoptec</td><td>SZ780</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Motor-aangedreven Manipulator</td><td>NARISHIGE</td><td>MM-94</td><td>Voor het controleren van de positie van de micropipet tijdens de micro-injectieprocedure</td></tr><tr><td>Multi-Sample Tissue Grinder</td><td>jingxin</td><td>Tissuelyser-64</td><td>Vermalen en homogeniseren van de eieren</td></tr><tr><td>Ovipositie pot</td><td>ChangShengYuanYi</td><td>CS-11</td><td>Gevuld met natte steriele zand voor het leggen van sprinkhanen eieren erin. De oocysten worden uit deze container verzameld. Online gekocht.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>ParafilmM</td><td>PM996</td><td>Voor het inpakken van de petrischalen.</td></tr><tr><td>pEASY-T3 Cloning Kit</td><td>TransGen Biotech</td><td>CT301-01</td><td>Voor TA cloning</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>NEST</td><td>752001</td><td>Voor het kweken en bewaren van&nbsp; de eieren.</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>Research plus</td><td>Voor monsterbelasting</td></tr><tr><td>Kunststof kweekcup</td><td></td><td></td><td>Voor het afzonderlijk opvoeden van sprinkhanen en elke plastic cup groot genoeg (niet minder dan 1000 mL in volume) zal het doen. Online gekocht.</td></tr><tr><td>Precision gRNA Synthese Kit</td><td>Thermo</td><td>A29377</td><td>Voor sgRNA synthese</td></tr><tr><td>Primer Premier</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Primer Premier 5.00</td><td>Voor primer ontwerp</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Insightful Science</td><td>SnapGene&reg;4.2.4</td><td>Voor het analyseren&nbsp; van sequenties</td></tr><tr><td>Stalen ballen</td><td>HuaXinGangQiu</td><td>HXGQ60</td><td>Voor monster vermalen.Online gekocht.</td></tr><tr><td>Tips</td><td>bioleaf</td><td>D781349</td><td>Voor monsterbelasting</td></tr><tr><td>Trans DNA Marker II</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM411-01</td><td>Gebruikt om gengrootte te bepalen</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo</td><td>A36496</td><td>Cas9 eiwit</td></tr><tr><td>UniversalGen DNA Kit</td><td>Cwbio</td><td>CWY004</td><td>Voor genomische DNA extractie</td></tr><tr><td>VANNAS Scharen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72932-01</td><td>Voor het afsnijden van de antennes</td></tr><tr><td>Tarwe</td><td></td><td></td><td>Om tarwe zaailingen te genereren als voedsel voor sprinkhanen. Gekocht van lokale boeren.</td></tr><tr><td>ZiFiT</td><td></td><td></td><td>Online website voor het ontwerpen van sgRNA's, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.</td></tr></tbody></table>

constructie van homozygote mutanten van trekkende sprinkhanen met behulp van crispr/cas9-technologie

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

De treksprinkhaan, Locusta migratoria, is niet alleen een van de wereldwijde pestsprinkhanen die enorme economische verliezen voor de mens veroorzaakten, maar ook een belangrijk onderzoeksmodel voor insectenmetamorfose. Het CRISPR/Cas9-systeem kan nauwkeurig lokaliseren op een specifieke DNA-locus en splitsen binnen de doellocatie, waarbij efficiënt dubbelstrengsbreuken worden geïntroduceerd om doelgen knock-out te induceren of nieuwe genfragmenten in de specifieke locus te integreren. CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking is een krachtig hulpmiddel voor het aanpakken van vragen in sprinkhanenonderzoek en een veelbelovende technologie voor sprinkhanenbestrijding. Deze studie biedt een systematisch protocol voor CRISPR / Cas9-gemedieerde gen knock-out met het complex van Cas9-eiwit en single guide RNA's (sgRNA's) in migrerende sprinkhanen. De selectie van doellocaties en het ontwerp van sgRNA worden in detail beschreven, gevolgd door in vitro synthese en verificatie van de sgRNA's. Daaropvolgende procedures omvatten het verzamelen van eiervlotten en scheiding van gelooide eieren om succesvolle micro-injectie met een laag sterftecijfer te bereiken, eikweek, voorlopige schatting van de mutatiesnelheid, sprinkhanenteelt en detectie, behoud en passage van de mutanten om de populatiestabiliteit van de bewerkte sprinkhanen te waarborgen. Deze methode kan worden gebruikt als referentie voor CRISPR/Cas9-gebaseerde genbewerkingstoepassingen bij migrerende sprinkhanen en bij andere insecten.

Dit protocol bevat de gedetailleerde stappen voor het genereren van homozygote mutanten van de migrerende sprinkhanen met de RNP bestaande uit Cas9-eiwit en in vitro gesynthetiseerd sgRNA. Hieronder volgen enkele representatieve resultaten van CRISPR/Cas9-gemedieerde doelgen knock-out bij sprinkhanen, waaronder doelselectie, sgRNA-synthese en -verificatie (figuur 1A), eicelverzameling en -injectie, mutantscreening en -passaging, cryopreservatie en reanimatie van de homozygote eieren...

Deze studie biedt een systematisch geoptimaliseerde procedure van CRISPR/Cas9 ribonuclease-gebaseerde constructie van homozygote sprinkhanenmutanten en een gedetailleerde methode voor cryopreservatie en reanimatie van de sprinkhaneneieren.

Constructie van homozygote mutanten van trekkende sprinkhanen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

De treksprinkhaan is een belangrijke landbouwtest. Deze methode biedt een efficiënt en gemakkelijk op te leveren protocol voor de gendrukmethoden van de Het is een systematische en gedetailleerde methode van een CRISPR / CAS9-constructie van homozygote sprinkhanenmutanten, inclusief eicelverzameling, mutantenscreening en de homozygote onderhoud. Bereid om te beginnen de injectienaalden voor door aan de glazen haarvaten te trekken met een micropipettrekker.Stel de parameters in zoals beschreven in het tekstmanuscript en maal vervolgens de punt van de injectienaald met een micromolen. Bereid ribonucleo-eiwit voor op de injectie door één microliter Cas9-eiwit te mengen met één microliter van het geverifieerde single guide-RNA. Voeg vervolgens acht microliter vrij steriel water van RNA toe om het uiteindelijke volume van het mengsel te maken, 10 microliter.Meng de oplossing grondig en leg deze op ijs. Verzamel vervolgens de vers gelegde eidozen van de eicelpositie en wacht tot het looien van de eieren. Gebruik na 30 minuten een fijne borstel om de eieren uit de eierdozen in water te isoleren en was de eieren drie keer met steriel water.Leg de eieren vervolgens in een petrischaaltje en voeg steriel water toe om ze vochtig te houden. Vul de injectienaald met de bereide ribonucleo-eiwitoplossing en laad de injectie in de micromanipulator. Stel de micro-injectieparameters in op 300 Hectopascal injectiedruk, 0,5 seconden injectietijd en 25 Hectopascal compensatiedruk.Wanneer de parameters zijn ingesteld, drukt u op het pedaal om het volume van de geïnjecteerde oplossing te evalueren. Pas de injectiedruk en injectietijd aan om ervoor te zorgen dat het injectievolume ongeveer 50 tot 100 nanoliter is. Nadat u de steriele eieren regelmatig op het injectiekussen hebt gerangschikt, plaatst u de pad op de objecttafel van de microscoop en past u de vergroting van de microscoop aan totdat de eieren worden waargenomen.Stel vervolgens de microinjectienaald onder de microscoop in totdat de injectiepunt zichtbaar is en plaats de punt in de buurt van het te injecteren ei. Start de injectie op een geschikte hoogte en een hoek van 30 tot 45 graden. Steek de punt in het ei in de buurt van de microstapels van het ei en druk op het pedaal om de injectie te voltooien.Trek vervolgens de naald snel in en beweeg het injectiekussen voor injectie van het volgende ei. Breng de geïnjecteerde eieren over in een kweekschaal met een stuk vochtig filtreerpapier. Plaats ze in een couveuse bij 30 graden Celsius.Controleer na injectie elke dag de ontwikkeling van de geïnjecteerde eieren. Breng de geïnjecteerde eieren in de eerste vijf dagen elke 24 uur over in een nieuwe kweekschaal. Op de zesde dag na de injectie, willekeurig plukken en overbrengen 10 eieren in een buis en voldoende malen de eieren met twee stalen ballen op 60 hertz gedurende zes minuten met behulp van een molen.Na het malen, resuspensie het puin in een milliliter PBS. Breng vervolgens vijf microliter van het geresuspendeerde mengsel over in 45 microliter 50 millimolair natriumhydroxide om gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius te lyseren. Om de alkalische lysisreactie te beëindigen, voegt u vijf microliter van één kies Tris-hydrochlorideoplossing toe aan het lysissysteem.Neem één microliter van het lysisproduct als pcr-sjabloon om het doelgenfragment te versterken. Vergelijk na de PCR en sequencing de sequencingresultaten met de wildtypesequentie om te evalueren of het CRISPR/Cas9-systeem het doelgen in vivo heeft gesplitst. Laat de rest van de eieren voor verdere ontwikkeling als indels worden gedetecteerd in het embryonale stadium.Na ontwikkeling, overbrenging en kweek de uitgekomen nimfen in een opfokkooi zoals beschreven in het manuscript. Wanneer de nimfen zich ontwikkelen tot het vijfde instar-stadium, scheid ze dan met plastic kweekbekers. Voer kruisingen uit met behulp van de G0-mutanten en wildtype sprinkhanen.Gebruik na het verzamelen van oassisten drie tot zes ontwikkelde eieren in elke oassist om mutaties te detecteren zoals eerder beschreven. Houd mutatiepositieve oassisten voor de volgende ontwikkeling en verlaat de mutatienegatieve oassisten. Voor cryo-conservering, was de eieren met steriel water en incubeer ze in een kweekschaal zoals eerder uitgelegd.Verzamel na vijf tot zes dagen de eieren samen in de kweekschaal en bedek ze met filterpapierfragmenten. Wikkel vervolgens het hele kweekgerecht in met een paraffinefilm. Zet de schaal twee dagen op 25 graden Celsius, gevolgd door nog eens twee dagen op een lagere temperatuur van 13 tot 16 graden Celsius.Zet de schaal vervolgens over naar een koelkast van zes graden Celsius. Voeg om de twee weken water toe aan het gerecht om de eieren een vochtige omgeving te bieden. Tot slot, voor het reanimeren van de gecryopreserveerde eieren, plaats je de petrischaal gedurende twee dagen op 25 graden Celsius.Plaats de eieren later in een broedmachine van 30 graden Celsius totdat de nimfen uitkomen. In dit onderzoek bevond de doellocatie voor het CRISPR/Cas9-systeem zich in het eerste exon. In de Cas9-splitsingstest kon het CRISPR / Cas9-ribonucleo-eiwit het PCR-fragment met de doellocatie verteren met een splitsingssnelheid van ongeveer 55% De sequencingresultaten voor schatting van de mutatiesnelheid in het embryonale stadium suggereerden efficiënte genoombewerking op de doellocatie.De bewerkingsefficiëntie resulteerde in een broedpercentage van 52,73% nimf en 66,67% van de G0-volwassenen waren mozaïekmutanten. De passaging-strategie van de mutantenlijnen wordt hier getoond. De overtollige homozygote eieren werden gecryopreserveerd om de benuttingsgraad van de homozygoten te verbeteren.Hoewel de broedsnelheid van de gecryopreserveerde eieren werd verminderd met de verlenging van de cryopreservatietijd, waren de corrigerende acties zoals het aanbrengen van filterpapierfragmenten en het herstellen van deze geconserveerde eieren met een gradiënt van stijgende temperatuur nuttig voor de reanimatie. Het belangrijkste is om te proberen de mechanische schade veroorzaakt door micro-injectie te beperken. Deze procedure kan worden gebruikt als referentie voor het bereiken van andere insecten.Een deel van sommige details, zoals methoden voor het verzamelen van eieren, injectie en het gewas, moet worden gewijzigd. Deze techniek kan ook nuttig zijn om metamorfose en de omgevingsaanpassing van de insecten te bestuderen en de constructie van homozygote sprinkhanenmutanten versnelde het onderzoek op dit gebied.

construction-homozygous-mutants-migratory-locust-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.

Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.

Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

Dit protocol beschrijft de stappen van CRISPR/Cas9 gerichte mutagenese bij zandvliegen: embryoverzameling, injectie, insectenopfok en identificatie, evenals selectie van mutaties van belang.

Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese

Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo's via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.

Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Dit artikel presenteert de stapsgewijze protocollen voor CRISPR/Cas9-mutagenese van de Oosterse fruitvlieg Bactrocera dorsalis. Gedetailleerde stappen in dit gestandaardiseerde protocol zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor functionele genstudies in B. dorsalis.

Protocollen voor CRISPR/Cas9 Mutagenese van de Oosterse Fruitvlieg Bactrocera dorsalis

Leer CRISPR/Cas9-methoden voor het construeren van homozygote sprinkhaanmutanten met embryo-cryopreservatie. Dit protocol versnelt genetisch onderzoek naar insectenbiologie en plaagbeheer.

Constructie van homozygote mutanten van trekkende sprinkhanen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie

Meer video's verkennen