Name: Karakterisering van Salmonella Typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Leer een gestandaardiseerd muismodel voor peritoneale sepsis met Salmonella Typhimurium. Deze methode helpt onderzoekers ontstekingsreacties en dodelijke gastheerreacties tijdens sepsis bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de Central Animal Facility, IISc voor het leveren van muizen voor onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door subsidies aan DpN van het Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board, Government of India. De infrastructurele ondersteuning van het DBT-IISc-programma en DST-FIST-subsidies worden zeer erkend. Wij danken alle eerdere en huidige leden van het DpN lab voor hun steun.

Alle experimenten met Salmonella Typhimurium werden uitgevoerd in Bio Safety Level 2 (BSL-2) faciliteiten. Er moet voor worden gezorgd dat de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) worden gebruikt, de veiligheid wordt gewaarborgd en de standaard BSL-2 biohazard-verwijderingsmethoden worden gevolgd. Alle muizenexperimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Ethics Committee, IISc. Muizen werden gefokt en onderhouden in de Central Animal Facility van IISc (registratienummer: 48/1999/CPCSEA, gedateerd 1/3/1999), goedgekeurd door het ministerie van Milieu en Bos, regering van India. De experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de Commissie voor Doel en Controle en Toezicht op Dierproeven met het goedgekeurde vergunningsnummer CAF/Ethics/797/2020.
BSL2-definitie: Een BSL2-classificatie geeft aan dat de biogevaarlijke agentia een matige bedreiging vormen voor het milieu en het laboratoriumpersoneel5.
1. Kweekvoorbereiding van Salmonella Typhimurium         
<ol><li>Voeg 100 μL Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glycerolbouillon toe aan 3 ml Luria Bertani (LB) bouillon. Incubeer de cultuur 's nachts bij 160 tpm bij 37 °C.</li>
	<li>Streep 50 μL van de 's nachts gekweekte cultuur in LB-bouillon op een Salmonella Shigella (SS) agarplaat en incubeer bij 37 °C gedurende ~ 12 uur. Bewaar de SS-agarplaat met de bacteriekolonies bij 4 °C gedurende enkele dagen vóór het in vivo infectie-experiment.</li>
	<li>Kies een enkele kolonie uit de gestreepte SS-agarplaat met behulp van een microtip. Werp de microtip uit in 3 ml LB bouillon en kweek bij 160 tpm bij 37 °C 's nachts.</li>
	<li>Voeg 0,1 ml van de bacteriecultuur toe aan 50 ml LB-bouillon en incubeer bij 37 °C in een schudderincubator bij 160 tpm gedurende 3-4 uur om de logaritmische groeifase te bereiken. Verdun de cultuur met een factor 2 met behulp van LB-bouillon. OPMERKING: Tijdens de logaritmische fase zijn bacteriële cellen op hun best gezond en delen ze zich actief.</li>
	<li>Meet de optische dichtheid (OD) van de cultuur bij 600 nm golflengte van het licht in een spectrofotometer of microplaatlezer. Zodra de OD 1,0 bereikt, maakt u twee aliquots van 1 ml cultuur in 1,5 ml microfugebuizen.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij 7.750 × g . Gooi het supernatant weg en was de pellet met 1 ml 1x PBS 2x. Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten bij 7.750 × g .</li>
	<li>Resuspend de pellet in 0,5 ml 1x PBS in twee verschillende 1,5 ml microfugebuizen. Combineer de suspensies van beide buizen in één buis van 1,5 ml die nu ~ 2 × 108 kolonievormende eenheden (CFU) / ml bevat.</li>
	<li>Bereid een bacteriële celsuspensie van 1 × 106 kve/ml door deze stamoplossing te verdunnen. LET OP: Optimaliseer de CFU die overeenkomt met OD onder specifieke laboratoriumomstandigheden om de CFU voor OD 1.0 te bepalen voordat de experimenten worden gestart.</li>
</ol>2. Muizen en infecties
<ol><li>Huis 8-10 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen met een gewicht van ~ 20 g in de schone lucht kamer van de dierenfaciliteit voor meerdere dagen voor acclimatisatie.</li>
	<li>Houd op de dag van infectie de muis met één hand vast, veeg de buikhuid af met 70% ethanol en spreid de achterpoten voor een betere toegankelijkheid van de buikwand.</li>
	<li>Injecteer 0,5 ml van 1 × 106 kve/ml bacteriële suspensie intraperitoneaal met behulp van een spuit van 1 ml. Daarom ontvangt elke muis 5 × 105 CFU. Controle, niet-geïnfecteerde muizen ontvangen 0,5 ml PBS alleen. Na infectie, plaat de cultuur om de werkelijke geïnjecteerde CFU te controleren, die kan variëren van 0,2-0,8 miljoen CFU / 0,5 ml.</li>
	<li>Zet de muizen terug in de kooien zoals toegewezen.</li>
	<li>Offer de muizen op met behulp van CO 2-verstikking ~ 12-18 uur na infectie voor de beste reactie. Meestal sterven alle geïnfecteerde muizen binnen 96 uur. Onder sommige experimentele interventies kunnen sommige muizen overleven. Euthanaseer deze muizen na 96 uur. Euthanaseer ook elke muis met een lichaamstemperatuur van minder dan 33,2 °C en acute nood bij 96 uur als een humaan eindpunt. OPMERKING: In dit model kunnen sommige muizen beginnen te sterven na 12 uur Salmonella-injectie . Plan daarom experimenten goed met meerdere tijdspunten.</li>
</ol>3. KvE-beoordeling van organen
<ol><li>Offer de geïnfecteerde muis op door CO 2-verstikking en veeg de buik af met een stuk katoen gedoopt in 70% ethanol. Snijd de buikhuid open. Raadpleeg het artikel van Ray en Dittel voor een videoprotocol over het verzamelen van peritoneale lavagevloeistof6. Snijd de peritoneale holte open en verzamel de organen van belang in microfugebuizen. Bovendien, als het bloed bij muizen met sepsis snel wordt gecoaguleerd en de hoeveelheden laag zijn, verzamel het dan snel na het offeren. OPMERKING: Deze video demonstreert de opsomming van orgaan-CFU uit de lever terwijl de lever uitgebreide histopathologische schade ondergaat in dit model van sepsis.</li>
	<li>Snijd een klein stukje van de lever en plaats het in een microfuge buisje. OPMERKING: Dit kan maximaal 2-3 uur op ijs worden bewaard voordat u doorgaat naar de volgende stap.</li>
	<li>Weeg en breng de stukken over in microcentrifugebuizen. Snijd bij voorkeur stukken met een gewicht van ~ 10-15 mg voor een goede homogenisatie. Gebruik hele organen in het geval van kleinere zoals de mesenteriale lymfeklieren (MLN's) of thymus.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml 1x PBS toe aan de buis en homogeniseer de organen met behulp van een handhomogenisator. Zorg ervoor dat de organen volledig gehomogeniseerd zijn. Vul het volume aan tot 1 ml door 0,5 ml 1x PBS toe te voegen.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel het supernatant in verse microfugebuizen en bereid verdunningen van 1 × 10−1 en 10−2 in een 96-well plaat.</li>
	<li>Verdeel 50 μL van het verdunningsmiddel over verse RVS-agarplaten en incubeer de platen bij 37 °C gedurende 12 uur.</li>
	<li>Tel het aantal kolonies dat in elke toestand voorkomt en normaliseer de gegevens met het orgaangewicht met behulp van vergelijking (1): Kve/mg = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1) OPMERKING: Het getal 20 wordt gebruikt in de formule om de kolonies per plaat om te zetten in KVE/ml. Dit aantal wordt bereikt door 1 ml te delen door de hoeveelheid van een bepaald volume van de gekweekte - in dit geval 50 μL. Als bijvoorbeeld 100 kolonies worden gevonden in een SS-agarplaat, waar 50 μL van een 1 × 10-1 verdunning van een gehomogeniseerd orgaan met een gewicht van 10 mg wordt verspreid, dan Kve/mg = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
</ol>4. Flowcytometrische analyse van verschillende immuuncelpopulaties in peritoneaal exsudaat
<ol><li>Verzamel de peritoneale cellen zoals eerder beschreven door Ray en Dittel6.</li>
	<li>Resuspend de celkorrel uit peritoneale lavagevloeistof in 1 ml RPMI aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Inventariseer de totale celaantallen in de peritoneale lavage met behulp van een hemocytometer. Pas het celnummer aan zodat elke buis 0,2-0,5 miljoen cellen ontvangt. OPMERKING: Peritoneale lavage bij muizen met sepsis kan RBC's bevatten, die waarschijnlijk verschijnen als gevolg van bloeding. Wees voorzichtig om RBC's uit te sluiten tijdens het tellen van peritoneale cellen. In de brightfield microscoop lijken RBC's veel kleiner dan de immuuncellen. Deze verschijnen als platte schijven of donuts, rond, met een inkeping in het midden, maar niet hol. Een stap naar lyse RBC's kan worden toegevoegd7.</li>
	<li>Draai de cellen gedurende 10 minuten met 200 × g bij 4 °C, gooi het supernatant weg en was de cellen 1x met 1x koude PBS. Centrifugeer de cellen bij 200 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Blokkeer de Fc-receptoren op PECs met behulp van FcR-blokker (1:400 verdunning), bereid in blokkerende buffer bestaande uit 5% FBS en 0,02% natriumazide in PBS. Incubeer op ijs gedurende 15 min.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 200 × g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg. Verdun de fluorchroom-geconjugeerde antilichamen die van belang zijn voor het blokkeren van buffer. Gebruik een verdunning van 1:500 van anti-muis LY6G om de neutrofielen te kleuren. OPMERKING: Andere immuuncelpopulaties kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van bijvoorbeeld anti-muis B220 voor B-cellen, anti-muis CD3 voor T-cellen en anti-muis F4/80 voor macrofagen.</li>
	<li>Incubateer ~ 0,2 miljoen cellen in 200 μL van de verdunde oplossingen van antilichamen in afzonderlijke buizen. Zet als negatieve controle één buis in elk fluorochroomtype opzij voor de niet-gekleurde controle om de cellen te incuberen met 200 μL blokkerende buffer zonder antilichaam.</li>
	<li>Incubeer de monsters op ijs gedurende 45 minuten met intermitterend tikken om de 15 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 200 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende ~ 15 minuten bij kamertemperatuur als ze meerdere dagen moeten worden bewaard. Het is echter het beste om gegevens te verkrijgen van vers gekleurde monsters in een flowcytometer.</li>
	<li>Resuspend de cellen in 200 μL FACS-kleuringsbuffer (2% FBS in PBS). Verkrijg de gegevens in een flowcytometer.</li>
</ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Sepsis and septic shock.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).</li>
<li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990-2017%3A+Analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+study+of+the+prevalence+and+outcomes+of+infection+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units.</a> JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).</li>
<li>Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+murine+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Current murine models of sepsis.</a> Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).</li>
<li>Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+and+biohazards%3A+Understanding+biosafety+levels+and+meeting+safety+requirements+of+a+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Biobanking%22%5BJournal%5D)">Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank.</a> Biobanking. 1897, 213-225 (2019).</li>
<li>Ray, A., Dittel, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Peritoneal+Cavity+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488(2010).</li>
<li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-protocol. 5 (20), 1631(2015).</li>
<li>Yadav, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+2+enhances+the+survival+of+mice+during+Salmonella+Typhimurium+infection-induced+sepsis+by+increasing+reactive+oxygen+species%2C+inflammatory+cytokines+and+recruitment+of+neutrophils+to+the+peritoneal+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity.</a> Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).</li>
<li>Verma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+hemoglobin+is+a+marker+of+systemic+inflammation+in+mouse+models+of+sepsis%3A+A+Raman+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study.</a> Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).</li>
<li>Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+mouse+peritoneal+macrophages%3A+Heterogeneity%2C+development%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function.</a> Frontiers in Immunology. 6, 225(2015).</li>
<li>Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+pathophysiology+of+sepsis%2C+an+inflammatory+disorder%3A+Key+roles+of+oxidative+and+nitrosative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress.</a> Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dit artikel beschrijft een methode voor het induceren van een ernstige vorm van bacteriële sepsis door intraperitoneale injectie van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van anderen, omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is en dus hoogpathogeen, dat de klinisch relevante toestand van Gram-negatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model is systemisch, met 100% mortaliteit binnen 96 uur na infectie. Daarom is dit model instrumenteel in ...

Sepsis wordt gedefinieerd als een ontregelde systemische ontstekings- en immuunrespons op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging ver weg van de plaats van infectie of schade. Septische shock is een subgroep van sepsis die wordt gekenmerkt door hypotensie die aanhoudt tijdens volumereanimatie, met een aanzienlijk verhoogd risico op mortaliteit1. Het grote publiek is zich meer bewust geworden van deze aandoening tijdens de COVID-19-pandemie. Ondanks de hoge geassocieerde mortaliteit ontbreken uitgebreide epidemiologische gegevens over de wereldwijde last van sepsis vanwege de complexiteit van de diagnose. In 2017 waren er wereldwijd 48,9 miljoen sepsis-incidenties en 11 miljoen sterfgevallen, goed voor 19,7% van alle wereldwijde sterfgevallen2. Verder bleek uit een onderzoek naar de uitgebreide prevalentie van infectie en gerelateerde sepsis bij patiënten op de intensive care dat 62% van de positieve isolaten van patiënten Gram-negatieve organismen waren3.
Aanvankelijk richtten de onderzoeken naar sepsis zich op het afbakenen van microbiële pathogenese. Het begrijpen van de "gevaarhypothese", die dicteert hoe de gastheer zichzelf en niet-zelf onderscheidt, leidde echter tot het kantelen van de balans van sepsisonderzoek naar het begrijpen van de gastheerrespons op een binnendringende ziekteverwekker. De meest gebruikte muizenmodellen van sepsis omvatten het lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde endotoxemiemodel, polymicrobiale sepsismodellen, cecale ligatie en punctie (CLP) en colon ascendens stent peritonitis (CASP) en monobacteriële infectiemodellen4.
We hebben een muismodelsysteem gestandaardiseerd door peritoneale sepsis te induceren met behulp van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van anderen omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is dat de klinisch relevante toestand van Gram-negatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model is systemisch, met 100% mortaliteit binnen 96 uur na infectie. Daarom is dit model instrumenteel bij het bestuderen van de inflammatoire en dodelijke gastheerreacties. In dit model wordt sepsis geïnduceerd door intraperitoneaal injecteren van 0,5 miljoen kolonievormende eenheden (CFU) van Salmonella Typhimurium in een 8-10 weken oude C57BL / 6-muis. Systemische infectie kan worden bevestigd door het beoordelen van orgaan bacteriële belasting ~ 16 uur na infectie. Dit artikel toont Salmonella Typhimurium-geïnduceerde peritonitis sepsis bij muizen, karakteriseert de resulterende veranderingen in peritoneale celsamenstelling en kwantificeert bacteriële belasting in verschillende organen.

<table><tbody><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL steriele spuit met 26 G naald</td><td>Beckton Dickinson, Singapore</td><td>303060</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL microcentrifugebuisje</td><td>Tarsons, USA</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL steriele spuit met 21 G naald</td><td>Beckton Dickinson, Spanje</td><td>307758</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische fles</td><td>Tarsons, USA</td><td>441150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL graduele centrifugeerbuis</td><td>Tarsons, USA</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>50 mL graduele centrifugeerbuis</td><td>Tarsons, USA</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>Celverdeler</td><td>VWR, USA</td><td>VWRU60828-680</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>HiMedia, Mumbai, India</td><td>TS1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>FcR-blokker</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC rat anti-muis Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551460</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Handmatige homogenisator</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (Neubauer telkamer)</td><td>Rohem, India</td><td>I.S. 10269</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>HiMedia, Mumbai, India</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petri schotel</td><td>Tarsons, USA</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia, Mumbai, India</td><td>AT060-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella-Shigella Agar</td><td>HiMedia, Mumbai, India</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Kubota</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD FACSverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>N-biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weegmachine</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van salmonella typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is een ontregelde immuunrespons van de gastheer op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging op een plaats die ver verwijderd is van die van de infectie of schade. Momenteel omvatten de veelgebruikte muizenmodellen van sepsis lipopolysaccharide (LPS) -geïnduceerde endotoxemie, cecale ligatie en punctie (CLP) en monobacteriële infectiemodelsystemen. Dit protocol beschrijft een methode om de gastheerresponsen te bestuderen tijdens Salmonella Typhimurium-infectie-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen. S. Typhimurium, een Gram-negatieve intracellulaire ziekteverwekker, veroorzaakt tyfusachtige ziekte bij muizen.
Dit protocol werkt de kweekvoorbereiding, inductie van septische peritonitis bij muizen door intraperitoneale injectie en methoden om systemische gastheerresponsen te bestuderen uit. Verder wordt de beoordeling van bacteriële belasting in verschillende organen en de flowcytometrische analyse van verhoogde neutrofielenaantallen in de peritoneale lavage gepresenteerd. Salmonella Typhimurium-geïnduceerde sepsis bij muizen leidt tot een toename van pro-inflammatoire cytokines en snelle infiltratie van neutrofielen in de peritoneale holte, wat leidt tot een lagere overleving.
Elke stap in dit protocol is geoptimaliseerd, wat resulteert in een hoge reproduceerbaarheid van de pathogenese van septische peritonitis. Dit model is nuttig voor het bestuderen van immunologische reacties tijdens bacteriële sepsis, de rol van verschillende genen in ziekteprogressie en de effecten van geneesmiddelen om sepsis te dempen.

Een gedetailleerde karakterisering van de immuunrespons van de gastheer met behulp van dit specifieke model wordt getoond in eerdere publicaties 8,9. Enkele representatieve resultaten van het beschreven protocol worden in deze sectie weergegeven. Dit model heeft tot doel systemische infectie van S. te induceren. Typhimurium door intraperitoneale injectie van de bacteriecultuur om sepsis te induceren. Om de infectie te bevestigen, werden de lysaten van de...

Dit protocol beschrijft de inductie van Gram-negatieve monobacteriële sepsis in een muismodelsysteem. Het model is nuttig bij het onderzoeken van de inflammatoire en dodelijke gastheerreacties tijdens sepsis.

Karakterisering van Salmonella Typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Sepsis is een ontregelde immuunrespons van de gastheer op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging op een plaats die ver verwijderd is van die van infectie of schade. Het grote publiek is zich meer bewust geworden van deze aandoening, tijdens de COVID-19-pandemie. In 2017 waren er 48,9 miljoen sepsis-incidenten en 11 miljoen sterfgevallen wereldwijd, goed voor bijna 20% van alle wereldwijde sterfgevallen.Zoals te verwachten is, zijn de meeste gevallen in ziekenhuizen. In feite bleek uit een studie dat bijna 62% van de positieve isolaten van patiënten op IC's met sepsis gramnegatieve organismen waren. Er zijn verschillende modellen, en enkele van de meest gebruikte muizenmodellen van sepsis omvatten LPS-geïnduceerde endotoxemie, het cecale ligatie- en punctiemodel en de monobacteriële infectiemodelsystemen.In ons laboratorium hebben we een muismodelsysteem gestandaardiseerd om peritoneale sepsis te induceren met behulp van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van andere, omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is dat de klinisch relevante toestand van gramnegatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model, is systemisch met 100% mortaliteit, binnen 96 uur na infectie.Daarom is dit model instrumenteel bij het bestuderen van de inflammatoire gastheerreacties. In dit model wordt sepsis geïnduceerd door intraperitoneaal injecteren van 0,5 miljoen CFU van Salmonella Typhimurium, in een 8-10 weken oude C57BL / 6 muis. Systemische infectie kan worden bevestigd, door het beoordelen van orgaan bacteriële belasting, ongeveer 16 uur na infectie.De experimenten met Salmonella Typhimurium vereisen BSL-2-faciliteit en naleving van BSL-2-richtlijnen. Er moet voor worden gezorgd dat de juiste PBM's worden gebruikt en dat de veiligheid wordt gewaarborgd en dat de standaard BSL-2 biohazard-verwijderingsmethoden worden gevolgd. Alle experimenten zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierethiek.Kweekvoorbereiding van Salmonella Typhimurium. Voeg honderd microliter Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glycerolbouillon toe aan 3 ml LB-bouillon. Incubeer de cultuur met 160 omwentelingen per minuut, bij 37 graden 's nachts.Streep 50 microliter van de 's nachts gekweekte cultuur in LB-bouillon op een Salmonella Shigella-agarplaat en incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Kies een enkele kolonie uit de gestreepte SS-agarplaat met behulp van een microtip. Werp de microtip uit in 3 ml LB-bouillon en kweek 's nachts bij 160 RPM bij 37 graden Celsius.Voeg 0,1 ml van de bacteriecultuur toe aan 50 ml LB-bouillon en incubeer bij 37 graden Celsius, in een schudderincubator met 160 RPM, gedurende drie tot vier uur, om de logaritmische groeifase te bereiken. Verdun de cultuur met een factor twee met behulp van LB-bouillon. Meet de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer golflengte van licht in een spectrofotometer.Zodra de OD er één bereikt, maak je twee aliquots van 1 ml cultuur, in 1,5 ml microfugebuizen. Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten op 7.750 G. Gooi dit supernatant weg en was de pellet tweemaal met 1 ml 1XPBS.Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten op 7.750 G. Resuspend de pellet in 0,5 ml 1XPBS, in twee verschillende 1,5 ml microfugebuizen. Combineer de suspensies van beide buizen tot één buis van 1,5 ml, die nu ongeveer twee vermenigvuldigd met 10 bevat, verhoogd tot het vermogen van acht kolonievormende eenheden per ml.Bereid een bacteriële celsuspensie van 10 vermogen zes kve / ml, door de stamoplossing te verdunnen. Belangrijke opmerking, optimaliseer de CFU die overeenkomt met OD in uw laboratorium, om de CFU voor OD één te bepalen, voordat u de experimenten start. Muizen en infecties.Houd op de dag van infectie de muis met één hand vast, veeg de buikhuid af met 70% ethanol en spreid de achterpoten voor een betere toegankelijkheid van de buikwand. Injecteer 0,5 ml van 10 verhoogd tot het vermogen zes CFU / ml bacteriële suspensie intraperitoneaal, met behulp van een spuit van 1 ml. Na infectie, plaat de cultuur om de werkelijke geïnjecteerde CFU te controleren, die kan variëren van 0,2 tot 0,8 miljoen CFU per 0,5 ml.CFU-beoordeling van organen. De muis werd opgeofferd met behulp van kooldioxide verstikking. Na het offeren van de geïnfecteerde muis, veeg de buik af met een stuk katoen, gedoopt in 70% ethanol.Snijd de buikhuid open. Raadpleeg het artikel van Ray en Dittle, voor een videoprotocol, over het verzamelen van peritoneale lavagevloeistof. Snijd de peritoneale holte open en verzamel het interessante orgaan.In deze video demonstreren we de opsomming van orgaan-kve uit de lever. De lever ondergaat uitgebreide histopathologische schade, in dit model van sepsis. Snijd een klein stukje lever en plaats het in een microfuge buisje.Dit kan twee tot drie uur in ijs worden bewaard, voordat u doorgaat naar de volgende stap. Weeg het stuk en breng het over in een microfugebuis. Snijd bij voorkeur de stukken met een gewicht van ongeveer 10 tot 15 mg, voor een goede homogenisatie.Voeg 0,5 ml 1XPBS toe in de buis en homogeniseer de organen met behulp van een handhomogenisator. Zorg ervoor dat de organen volledig gehomogeniseerd zijn. Maak het volume aan tot 1 ml door 0,5 ml 1XPBS toe te voegen.Centrifugeer de buisjes gedurende vijf minuten bij 200 G, bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant in verse microfugebuizen. Bereid verdunningen van 10 tot de macht minus één en 10 tot de macht minus twee, in een 96 putplaat.Verdeel 50 microliter van het verdunningsmiddel op verse RVS-agarplaten en incubeer de platen gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Tel het aantal kolonies dat in elke toestand verschijnt en normaliseer de gegevens met het orgaangewicht met behulp van de volgende formule. Kve/mg is gelijk aan het aantal kolonies, vermenigvuldigd met 20, vermenigvuldigd met de verdunningsfactor, het geheel gedeeld door orgaangewicht in mg.Let op, het getal 20 wordt gebruikt in de formule, om de kolonies per plaat om te zetten in CFU / ml. Dit getal wordt bereikt door 1 ml te delen van de hoeveelheid van een bepaald volume cultuur. In dit geval 50 microliter.Als u bijvoorbeeld honderd kolonies in een SS-agarplaat vindt, waar 50 microliter van 10 vermogen minus één verdunning van gehomogeniseerd orgaan, met een gewicht van 10 mg wordt verspreid, dan is CFU / mg gelijk aan 100 vermenigvuldigd met 20, vermenigvuldigd met 10, het geheel gedeeld door 10, wat gelijk is aan 2000 CFU / mg. Flowcytometrische analyse van verschillende immuuncelpopulaties in peritoneaal exsudaat. Verzamel de peritoneale cellen zoals eerder beschreven, door Ray en Dittle.Resuspend de celkorrel uit peritoneale lavagevloeistof, in 1 ml RPMI aangevuld met 10% FBS. Som de totale celaantallen in de peritoneale lavage op met behulp van een hemocytometer. Pas het celgetal zo aan, dat elke buis twee tot vijf vermenigvuldigd met 10 krijgt, verhoogd tot de kracht van vijf cellen.Draai de cellen gedurende 10 minuten bij 200 G bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg. Was de cellen eenmaal met 1XPBS.Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 200 G. Blokkeer de Fc-receptoren met behulp van FcR-blokker. Een daarvan is tot 400 verdunning, bereid in blokkerende buffer, bestaande uit 5% FBS en 0,02% natriumazide in PBS.Incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 200 G. Gooi het supernatant weg.Verdun de fluorochroom geconjugeerde antilichamen die van belang zijn voor het blokkeren van de buffer. Hier gebruiken we een is tot 500 verdunning van anti-muis Ly6G, om neutrofielen te kleuren. Let op, andere immuuncelpopulaties kunnen ook worden getoond, met behulp van anti-muis B220 voor B-cellen, anti-muis CD3 voor T-cellen, anti-muis F4/80 voor macrofagen, enzovoort.Incubateer ongeveer 0,2 miljoen cellen in 200 microliter verdunde oplossingen van antilichamen, in afzonderlijke buizen. Zet als negatieve controle één buis opzij in elk fluorochroom type, voor niet-gekleurde controle. In deze buis incubeer je de cellen met 200 microliter blokkerende buffer zonder antilichaam.Incubeer de monsters gedurende 45 minuten op ijs, met intermitterend tikken om de 15 minuten. Centrifugeer de cellen bij 200 G gedurende 10 minuten, bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg.Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, indien nodig om meerdere dagen te bewaren. Resuspend de cellen in 200 microliter FACS-kleurbuffer, 2% FBS in PBS. Verkrijg de gegevens in de flowcytometer.De afbeeldingen van SS-agarplaten die hier worden getoond, geven de orgaan-CFU-belasting in lever en milt van septische muizen aan. Het gehomogeniseerde orgaan Lys6 werd verspreid bij verdunning van 10 tot het vermogen minus één, en geïncubeerd bij 37 graden celsius. De zwart gepigmenteerde S.Typhimurium kolonies verschenen na ongeveer 12 uur na de incubatie.Een deel van de plaat wordt hier weergegeven als ingezoomde inzet om de kolonies te markeren. Deze resultaten suggereren dat de ziekteverwekker met succes systemisch verspreidde en de interne organen koloniseerde. Deze figuur toont de sera geïsoleerd uit gezonde en septische muizen.Het volume van verzamelbaar bloed van septische muizen is minder dan gezonde controles, dus het verkregen serum is minder. Dit gebeurt vanwege verhoogde coagulatie bij sepsis. Ook de sera van septische muizen vertonen een duidelijke rode kleuring, wat wijst op het optreden van uitgebreide hemolyse.De figuur toont cytometrische plots van peritoneale cellen van gezonde en septische muizen, gekleurd met anti-Ly6G-antilichaam. Deze beelden zijn representatief voor één gezonde en twee geïnfecteerde muizen. Septische muizen zagen een verhoogde infiltratie van neutrofielen in de peritoneale holte.In deze video hebben we een methode getoond voor het induceren van bacteriële sepsis bij muizen, door intraperitoneale injectie van Salmonella Typhimurium. Dit is een nuttig model om de effecten van therapeutische interventies bij het verzachten van sepsis te bestuderen. In dit modelsysteem verandert de cellulaire samenstelling van de peritoneale holte dramatisch om de ziekteverwekker te bestrijden.Daarom is het een nuttig model bij het bestuderen van de kinetische veranderingen in immuuncelsamenstellingen en -functies tijdens sepsis. Het model is ook nuttig bij het begrijpen van de toename van intercellulaire reactieve zuurstofsoorten, pro-inflammatoire cytokineniveaus, hemolyse en bloedstolling, die allemaal plaatsvinden tijdens sepsis.

characterizing-salmonella-typhimurium-induced-septic-peritonitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Stel een chronische bacteriële infectie muismodel met...

Chronisch Salmonella Infected Muis Model

Transparante zebravis embryo's hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen,...

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

Source: Lo, B. C., et al. Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the quantification of bacterial load in a mouse model of chronic infection with streptomycin-resistant Salmonella typhimurium. Following euthanasia and sterile dissection, cecal and splenic tissues are harvested, homogenized with steel beads to release bacteria, and serially diluted. Dilutions are plated on selective agar, and visible colonies are counted to estimate...

Quantification of Tissue Bacterial Load in a Mouse Model of Chronic Intestinal Infection

Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.

De<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

Een high-throughput assay in vitro fenotype Salmonella of andere bacteriële vereniging, invasie en replicatie in fagocytische cellen met hoge doorvoer capaciteit ontwikkeld. De methode werd gebruikt om Salmonella-gen knock-out mutantstammen evalueren op hun betrokkenheid in gastheer-pathogeen interacties.

High-throughput Assay om Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, en replicatie in macrofagen

Dit protocol biedt de nodige maatregelen treffen en evalueren van neonatale sepsis in 7 dagen oude muizen.

Een gecontroleerde muismodel voor neonatale Sepsis van de Polymicrobial

Dit protocol beschrijft een muismodel van door salmonella gedreven intestinale fibrose dat lijkt op belangrijke pathologische kenmerken van de ziekte van Crohn, waaronder Transmurale ontsteking en fibrose. Deze methode kan worden gebruikt om gastheerfactoren te evalueren die fibrotische uitkomsten veranderen met Mutant muizen gehandhaafd op een C57Bl/6 genetische achtergrond.

Chronische salmonella infectie veroorzaakte intestinale fibrose

Een λ-Rood-gemedieerd recombinatiesysteem werd gebruikt om een deletiemutant te maken van een kleine niet-coderende RNA-micC.

Een niet-coderende kleine RNA MicC draagt bij aan virulentie in buitenmembraaneiwitten in Salmonella enteritidis

Salmonella dringt binnen en repliceert zich in intestinale epitheelcellen, zowel in Salmonella-specifieke vacuolen als vrij in het cytosol (hyperreplicatie). Een high-throughput fluorescentiemicroscopie-gebaseerd protocol wordt hier beschreven om de intracellulaire fenotypen van Salmonella te kwantificeren door middel van twee complementaire beeldanalyses via ImageJ, waarbij een eencellige resolutie en scoring wordt bereikt.

Geautomatiseerde analyse van intracellulaire fenotypen van Salmonella met behulp van ImageJ

De Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) is een zeer gestandaardiseerd model voor de polymicrobiale abdominale sepsis bij knaagdieren. Dit artikel beschrijft de chirurgische ingreep van CASP. Het CASP model en zijn varianten kan de systematisch onderzoek van verschillende problemen met betrekking tot het onderwerp van sepsis.

Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) - een gestandaardiseerd model voor polymicrobiële abdominale sepsis

Leer een gestandaardiseerd muismodel voor peritoneale sepsis met Salmonella Typhimurium. Deze methode helpt onderzoekers ontstekingsreacties en dodelijke gastheerreacties tijdens sepsis bestuderen.

Karakterisering van Salmonella Typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen

Meer video's verkennen