Name: Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Scopri la microdialisi cerebrale per il campionamento dinamico del liquido extracellulare ippocampale in ratti svegli. Questo metodo consente il monitoraggio continuo dei biomarcatori di malattie neurologiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82104533), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2021YJ0175) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273). Gli autori desiderano ringraziare Yuncheng Hong, ingegnere senior delle attrezzature presso Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapore) per la fornitura di servizi tecnici per la tecnica di microdialisi.

Il protocollo sperimentale è stato condotto in conformità con i requisiti del Comitato per l'uso di animali da laboratorio e l'uso istituzionale degli animali presso l'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (numero di registrazione: 2021-11). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague Dawley (SD) (280 ± 20 g, 6-8 settimane di età).
1. Chirurgia di impianto della sonda di microdialisi cerebrale
<ol><li>Utilizzare isoflurano al 3% e all'1,5% per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia del ratto, rispettivamente, utilizzando un sistema di anestesia animale in una miscela aria-ossigeno a 0,6 L/min. Assicurati che i ratti siano profondamente anestetizzati senza un riflesso del dolore e un riflesso corneale. Utilizzare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.</li>
	<li>Rimuovere la pelliccia sul cranio del ratto anestetizzato con un rasoio elettrico nell'area di preparazione. Quindi, fissare il ratto anestetizzato su un localizzatore cerebrale stereotassico. Disinfettare il sito chirurgico prima dell'operazione applicando povidone-iodio ed etanolo 3x sulla regione dell'intervento chirurgico con un batuffolo di cotone sterile. Applicare bupivacaina topicamente per l'analgesia locale. NOTA: L'intero processo di acquisizione del campione HECF basato sulla microdialisi è illustrato nella Figura 1.</li>
	<li>Fare un'incisione craniofacciale di 1,5 cm nel mezzo con le forbici chirurgiche e rimuovere il periostio usando forbici chirurgiche e pinze oftalmiche.</li>
	<li>Considera il bregma come la posizione basale e perfora l'endocranio per perforare un'apertura di 2 mm nella posizione anteroposteriore (AP) (-2 mm), nella posizione mediolaterale (ML) (-3,5 mm) e nella posizione dorsoventrale (DV) (-3,5 mm) (la regione CA1 dell'ippocampo) usando un trapano cranico.</li>
	<li>Fissare lo stiletto del catetere sulla pinza di un localizzatore cerebrale stereotassico e regolare la posizione dell'involucro di microdialisi nelle posizioni AP (-2 mm), ML (-3,5 mm) e DV (0 mm). Regolare il valore DV del localizzatore stereo cerebrale e impiantare l'involucro di microdialisi nella regione CA1 a una profondità di 3,5 mm. NOTA: Mantenere la temperatura dell'animale a 37 °C durante l'operazione utilizzando un mantenitore della temperatura animale.</li>
	<li>Forare altre tre aperture con un diametro di 2 mm in modo tale che le tre aperture formino un triangolo in cui l'apertura della sonda è posizionata centralmente. L'impianto si avvita nelle aperture ad una profondità di 1 mm.</li>
	<li>Fissare il catetere a sonda con cemento dentale e utilizzare una sutura chirurgica 4-0 per chiudere la pelle. Vedere la Figura 2 per il posizionamento della sonda.</li>
	<li>Metti il topo in gabbia per 7 giorni per recuperare. Infiltrarsi localmente in bupivacaina (1,5 mg/kg) una volta al giorno dopo l'intervento chirurgico.  Fornire cibo e acqua ad libitum. Utilizzare colliri ialuronati di sodio 3 volte al giorno per prevenire la secchezza dopo l'operazione. NOTA: Eseguire tutte le procedure in una sala chirurgica sterile. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non abbia riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale in una condizione di 37 °C. Non restituire l'animale che ha subito un intervento chirurgico alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ristabilito.</li>
</ol>2. Connessione del sistema di microdialisi e controllo della sonda
<ol><li>Collegare la pompa di microdialisi, la microsiringa, il dispositivo di attività sveglia e il raccoglitore di campioni criogenici secondo le istruzioni del produttore. Installare la microsiringa con ACSF sulla pompa per microdialisi e impostare la pompa di microdialisi su una velocità di 1 μL/min per scaricare l'aria nella tubazione.</li>
	<li>Collegare la tubazione e la sonda di microdialisi cerebrale (membrana: PAES; lunghezza della membrana: 4 mm; OD della membrana: 0,5 mm; taglio: 20 kDa; lunghezza dell'albero: 14 mm). Far funzionare la pompa di microdialisi ad una velocità di 1 μL/min per iniettare ACSF nella sonda fino a quando la superficie della sonda è leggermente umida. Immergere la sonda in una soluzione per iniezione di eparina sodica per un uso successivo. NOTA: Se un grande flusso di ACSF cade dalla membrana semipermeabile della sonda, come si vede ad occhio nudo sotto gravità, sostituire la sonda con una nuova.</li>
</ol>3. Raccolta di HECF dal ratto sveglio
<ol><li>Inserire la sonda di microdialisi cerebrale nel catetere della sonda e posizionare il ratto in una camera (altezza: 360 mm; diametro: 400 mm) con imbottitura per assicurarsi che i ratti siano liberi di muoversi.</li>
	<li>Collegare la tubazione, la pompa della microsiringa e la sonda di microdialisi cerebrale. Imbrigliare il ratto attraverso il foro nella parte superiore del dispositivo di ritenuta del ratto e le girelle in acciaio inossidabile.</li>
	<li>Accendere il controller girevole multicanale per evitare di intrecciare le tubazioni di microdialisi durante il libero movimento del ratto. Accendere la pompa della microsiringa e pompare l'ACSF ad una velocità di 1 μL/min. Raccogliere periodicamente l'HECF dopo un equilibrio di 60 minuti del sistema di raccolta HECF per microdialisi.</li>
	<li>Assicurarsi che la portata dei campioni HECF nel collettore di frazione refrigerata sia coerente con l'infusione di ACSF. Raccogliere 20 μL di HECF e passare automaticamente alla provetta di campionamento successiva. Assicurarsi di verificare se la membrana della sonda è danneggiata durante l'inserimento della sonda.</li>
</ol>4. Misurazione della pressione osmotica per l'HECF
<ol><li>Accendere l'osmometro e accedere al sistema di rilevamento. Fare clic sul pulsante Cal sul touch screen e fare clic sul pulsante Res nella pagina per cancellare la memoria di calibrazione precedente.</li>
	<li>Installare un tubo da 1,5 mL contenente 100 μL di acqua pura senza bolle sulla testa di misurazione. Tirare la testa di misurazione sul fondo del contenitore di idrazina fredda.</li>
	<li>Immettere il campione numero 0 sul touch screen e confermare per eseguire il test. Immergere rapidamente l'ago del diodo nella provetta del campione, quindi estrarlo rapidamente per indurre la cristallizzazione del campione a una temperatura di -6,2 °C.</li>
	<li>Attendi che lo schermo venga visualizzato: premi la misura verso l'alto e fai clic su Cal e Cal 0 a turno per calibrare. Eseguire misurazioni con una soluzione di calibrazione da 300 mOsm e misurare la pressione osmotica dei campioni HECF come descritto sopra. NOTA: Pulire la testina di misurazione con un tovagliolo di carta morbida dopo la calibrazione o la misurazione. I campioni HECF senza bolle devono essere miscelati bene.</li>
</ol>5. Manutenzione del sistema di microdialisi e dei dispositivi dopo il campionamento
<ol><li>Estrarre la sonda di microdialisi cerebrale dal catetere della sonda dopo la terminazione del campionamento. Immergere la sonda in acqua deionizzata e lavare con acqua deionizzata per 12 ore per rimuovere le deposizioni di sale spiaggiate dalla tubazione e dalla sonda.</li>
	<li>Rimuovere la sonda per metterla in una soluzione di tripsina allo 0,05% a 4 °C. Asciugare le tubazioni in forno ad aria asciutta a 25 °C e conservarle a temperatura ambiente. NOTA: Le sonde di microdialisi sono costose e questo passaggio può aumentare la riutilizzabilità delle sonde. Le proteine che aderiscono alla superficie della sonda possono essere digerite dalla soluzione di tripsina per evitare che la membrana della sonda venga bloccata dalle proteine e la tripsina non ha avuto alcun effetto sul materiale della sonda.</li>
</ol>6. Trattamento degli animali dopo il campionamento
<ol><li>Dopo il campionamento, eutanasia indolore i ratti facendoli inalare l'1,5% di isoflurano, seguito da un sovradosaggio di isoflurano al 5% in conformità con l'etica animale.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La patogenesi delle malattie del SNC non è ancora completamente compresa, il che ostacola lo sviluppo di nuove terapie e farmaci. Gli studi hanno dimostrato che la maggior parte delle malattie del SNC sono strettamente correlate alle lesioni ippocampali20,21,22. La tecnica di microdialisi cerebrale proposta può colpire regioni specifiche del cervello, in particolare l'ippocampo, che lo distingue dall'approccio tradizionale di ra...

Le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) con elevata morbilità, come le malattie neurodegenerative, le lesioni cerebrali traumatiche, le lesioni cerebrali indotte dall'ipossia ad alta quota e l'ictus ischemico, sono cause cruciali della crescente mortalità in tutto il mondo 1,2,3. Il monitoraggio in tempo reale delle citochine e dei cambiamenti proteici in specifiche regioni del cervello contribuisce all'accuratezza diagnostica delle malattie del SNC e degli studi di farmacocinetica cerebrale dopo i farmaci. La ricerca scientifica tradizionale utilizza l'omogenato del tessuto cerebrale o una raccolta manuale di liquido cerebrale interstiziale animale per la rilevazione di sostanze specifiche e per studi farmacocinetici. Tuttavia, ciò presenta alcune carenze, come una dimensione limitata del campione, l'incapacità di osservare dinamicamente i cambiamenti degli indicatori e una qualità di campionamento non uniforme 4,5,6. Il liquido cerebrospinale, un liquido interstiziale, protegge il cervello e il midollo spinale da danni meccanici. La sua composizione è diversa da quella del siero a causa dell'esistenza della barriera emato-encefalica (BBB)7. L'analisi diretta dei campioni di liquido cerebrospinale è più favorevole alla divulgazione del meccanismo delle lesioni del SNC e alla scoperta di farmaci. Inevitabilmente, i campioni di liquido cerebrospinale, ottenuti manualmente direttamente dalla cisterna magna e dai ventricoli cerebrali attraverso una siringa, presentano svantaggi di contaminazione del sangue, possibilità casuale di raccolta del campione, incertezza della quantità e quasi nessuna possibilità di prelievo multiplo 8,9. Più in particolare, i metodi convenzionali di campionamento dei fluidi cerebrali interstiziali non possono ottenere campioni da regioni cerebrali danneggiate, il che ostacola l'esplorazione della patogenesi delle malattie del SNC in specifiche regioni del cervello e la valutazione dell'efficacia delle terapie etnomediche mirate 9,10.
La microdialisi cerebrale è una tecnica per il campionamento del fluido cerebrale interstiziale negli animali svegli11. Il sistema di microdialisi imita la permeabilità vascolare con l'aiuto di una sonda impiantata nel cervello. La sonda di microdialisi è armata con una membrana semipermeabile e viene impiantata in specifiche regioni del cervello. Dopo la perfusione con liquido cerebrospinale artificiale isotonico (ACSF), il fluido cerebrale interstiziale dializzato può essere raccolto favorevolmente con i benefici di campioni di piccole dimensioni, campionamento continuo e osservazione dinamica12,13. In termini di localizzazione, le sonde di microdialisi cerebrale possono essere impiantate selettivamente in strutture cerebrali o cisterne craniche di interesse14. Un'osservazione di livelli anormali di una sostanza endogena nel liquido extracellulare ippocampale (HECF) suggerisce l'insorgenza di malattie del SNC o la patogenesi della malattia. Diversi studi hanno dimostrato che i biomarcatori per le malattie del SNC, come gli amminoacidi D nella schizofrenia, le proteine β-amiloide e tau nella malattia di Alzheimer, le catene leggere dei neurofilamenti nelle lesioni cerebrali traumatiche e l'ubiquitina carbossi-terminale idrolasi L1 nell'encefalopatia da ischemia ipossica, possono essere analizzati nel liquido cerebrospinale15,16,17 . Un metodo di analisi chimica basato sulla tecnica di campionamento della microdialisi cerebrale può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti dinamici di composti esogeni come i principi attivi dell'etnomedicina, che si diffondono e si distribuiscono in specifiche regioni cerebrali14.
Questo articolo presenta il processo specifico di acquisizione dinamica dell'HECF nei ratti svegli e misura la sua pressione osmotica per garantire la qualità del campione.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Forno di essiccazione ad aria</td><td>Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd</td><td>GHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia animale</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Mantenitore di temperatura animale</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>Liquido cerebrospinale artificiale</td><td>Beijing leagene biotech. Co., Ltd</td><td>CZ0522</td><td></td></tr><tr><td>Sonda</td> <td>per microdialisi cerebrale&nbsp; Catetere per microdialisi CMA AB</td><td>T56518</td><td></td></tr><tr><td></td><td> CMA Microdialisi AB</td><td>T56518</td><td></td></tr><tr><td>Imbracatura per infusione Covance</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>CIH95</td><td></td></tr><tr><td>Resine per protesi dentarie</td><td>Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd</td><td>190732</td><td></td></tr><tr><td>Trapano cranico elettrico</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>CP-5200</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio a movimento libero per animali</td><td>&nbsp; CMA Microdialisi AB</td><td>CMA120</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sodio iniezione</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>H51021208</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd</td><td>202201</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Catetere per microdialisi stiletto</td><td> CMA Microdialysis AB</td><td>8011205</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per prelievi per microdialisi</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>7431100</td><td></td></tr><tr><td>Collettore per microdialisi</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>CMA4004</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fep per microdialisi</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>3409501</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per microdialisi in vitro</td><td> CMA Microdialisi AB</td><td>CMA130</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per microiniezione per microdialisi</td><td>&nbsp; CMA Microdialisi AB</td><td>788130</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per microdialisi (1,0 ml)</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>8309020</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per tubi per microdialisi</td><td>&nbsp; CMA Microdialisi AB</td><td>3409500</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgiche non assorbibili Shanghai</td><td>Tianqing Biological Materials Co., Ltd</td><td>S19004</td><td></td></tr><tr><td>Pinze oftalmiche</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>Osmometro</td><td>L&ouml; ser</td><td>OM 807</td><td></td></tr><tr><td>Gocce oculari di ialuronato di sodio</td><td>URSAPHARM Arzneimittel GmbH</td><td>H20150150</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per stereotassi</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>68025</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>S14014-15</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd</td><td>BY-103</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa</td><td>&nbsp; CMA Microdialisi AB</td><td>T56518</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina</td><td>Boster Biological Technology, Ltd.</td><td></td><td></td>PYG0107</tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd</td><td>KMH1-240W8101</td><td></td></tr></tbody></table>

raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi

Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System

Una varietà di malattie del sistema nervoso centrale (SNC) sono associate a cambiamenti nella composizione del fluido extracellulare ippocampale (HECF). Tuttavia, la difficoltà di ottenere HECF in tempo reale da ratti coscienti ha a lungo limitato la valutazione della progressione della malattia del SNC e l'efficacia della terapia etnomedica. Incoraggiante, una tecnica di microdialisi cerebrale può essere utilizzata per il campionamento continuo con i vantaggi dell'osservazione dinamica, dell'analisi quantitativa e di una piccola dimensione del campionamento. Ciò consente il monitoraggio dei cambiamenti nel contenuto di fluido extracellulare per i composti delle erbe tradizionali e dei loro metaboliti nel cervello degli animali viventi. Lo scopo di questo studio era quindi quello di impiantare con precisione una sonda di microdialisi del liquido cerebrospinale nella regione ippocampale dei ratti Sprague Dawley (SD) con un apparato stereotassico cerebrale tridimensionale, tagliando pesi molecolari superiori a 20 kDa. L'HECF di alta qualità è stato quindi ottenuto da ratti coscienti utilizzando un sistema di controllo del campionamento in microdialisi con una frequenza di campionamento regolabile da 2,87 nL / min - 2,98 ml / min. In conclusione, il nostro protocollo fornisce un metodo efficiente, rapido e dinamico per ottenere HECF nei ratti svegli con l'aiuto della tecnologia di microdialisi, che ci offre possibilità illimitate per esplorare ulteriormente la patogenesi delle malattie correlate al SNC e valutare l'efficacia dei farmaci.

Seguendo il protocollo sperimentale di cui sopra e i parametri di campionamento stabiliti nella Tabella 1, è stato ottenuto HECF di ratto simile all'acqua, incolore e trasparente alla frequenza di campionamento impostata (Figura 1K). La pressione osmotica dell'HECF di ratto ottenuto era 290-310 mOsm/L, che può indirettamente garantire la qualità dei campioni18,19.
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Il protocollo qui fornisce un campionamento dinamico dettagliato in tempo reale del fluido extracellulare dall'ippocampo di ratti svegli utilizzando un sistema di microdialisi.

Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi

A variety of central nervous system (CNS) diseases are associated with changes in the composition of hippocampal extracellular fluid (HECF). However, ...

Il fluido extracellulare ippocampale e la folla mediante la tecnica di microdialisi cerebrale contribuiscono a monitorare la micro malattia specifica delle malattie nervose centrali. La microdialisi cerebrale tecnica raggiunge l'inquisizione dinamica e continua del fluido cerebrale interstiziale in specifiche regioni cerebrali di ratti non anestetizzati. Inizia fissando il ratto anestetizzato su un localizzatore cerebrale stereotassico e pulisci l'area chirurgica rasata con un tampone di iodio povidone ed etanolo tre volte prima dell'operazione.Quindi eseguire un'incisione facciale cranica di 1,5 centimetri nel mezzo con forbici chirurgiche e rimuovere il periostio usando forbici chirurgiche e pinze oftalmiche. Considerando il bregma come posizione basale, usando un trapano cranico perforare l'endocranio per perforare un'apertura di due millimetri nella regione CA1 dell'ippocampo. Ora fissa la stilette del catetere sulla pinza di un localizzatore cerebrale stereotassico e regola la posizione dell'involucro di microdialisi nelle posizioni ventrale anteroposteriore, mediolaterale e dorsale.Regolare la valvola dorsoventrale del localizzatore stereo cerebrale e impiantare l'involucro di microdialisi nella regione CA1 a una profondità di 3,5 millimetri. Forare altre tre aperture con un diametro di due millimetri in modo tale che le tre aperture formino un triangolo in cui l'apertura della sonda è posizionata centralmente. L'impianto si avvita nelle aperture ad una profondità di un millimetro e fissa il catetere della sonda con cemento dentale.Quindi utilizzare una sutura chirurgica 4-O per chiudere la pelle. Collegare la microsiringa della pompa di microdialisi con il dispositivo ACSF a attività sveglia e il raccoglitore di campioni criogenici secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, per scaricare l'aria nella tubazione, impostare la pompa di microdialisi ad una velocità di un microlitro al minuto.Quindi collegare la tubazione e la sonda di microdialisi cerebrale e azionare la pompa di microdialisi ad una velocità di un microlitro al minuto per iniettare ACSF nella sonda fino a quando la superficie della sonda è leggermente umida. Immergere la sonda in una soluzione di iniezione di eparina sodica per un uso successivo. Per raccogliere l'HECF dal ratto sveglio, inserire la sonda di microdialisi cerebrale nel catetere della sonda e posizionare il ratto in una camera con imbottitura per garantire che i ratti siano liberi di muoversi.Accendere il controller girevole multicanale per evitare di intrecciare le tubazioni di microdialisi durante il libero movimento del ratto. Quindi accendere la pompa della microsiringa e pompare l'ACSF ad una velocità di un microlitro al minuto. Dopo un equilibrio di 60 minuti del sistema di raccolta HECF in microdialisi, raccogliere HECF periodicamente.Dopo la terminazione del campionamento, estrarre la sonda di microdialisi cerebrale dal catetere della sonda. Immergere la sonda in acqua deionizzata e lavare con acqua deionizzata per 12 ore per rimuovere le deposizioni di sale incagliate dalla tubazione e dalla sonda. Rimuovere la sonda e inserirla in una soluzione di tripsina allo 0,05% a quattro gradi Celsius.Il fluido extracellulare ippocampale acquisito dalla tecnica di microdialisi cerebrale è simile all'acqua, incolore e trasparente alla frequenza di campionamento impostata. Le procedure più importanti sono l'impianto della microdialisi con cura nella regione CA1 e l'inserimento della sonda nel catetere pop. La tecnica della microdialisi semplice consente di assistere il cambiamento dinamico dei marcatori di malattia in specifiche regioni del cervello, la sostanza dell'efficacia del farmaco e il catabolismo tissutale dei componenti del farmaco.

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Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi (Video) | JoVE Journal

Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi

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