Screening ad alta produttività per ottenere colpi cristallini per la cristallografia proteica
March 10th, 2023
Questo protocollo descrive in dettaglio lo screening di cristallizzazione ad alto rendimento, che va dalla preparazione della piastra di microdosaggio di 1.536 alla fine di una finestra temporale sperimentale di 6 settimane. Sono inclusi dettagli sulla configurazione del campione, sull'imaging ottenuto e su come gli utenti possono eseguire analisi utilizzando un'interfaccia utente grafica abilitata all'intelligenza artificiale per identificare in modo rapido ed efficiente le condizioni di cristallizzazione macromolecolare.
Ottenere un cristallo per eseguire esperimenti di diffrazione rimane una sfida perché è difficile prevedere quali parametri influenzeranno la cristallizzazione. Favoriamo lo sperimentatore esaminando le condizioni di cristallizzazione 1536 in una singola lastra e utilizzando tecnologie di imaging avanzate per identificare anche i più piccoli colpi di cristallo. Le tecniche di biologia strutturale si stanno sviluppando rapidamente e il campo è stato rivoluzionato dalla previsione della struttura computazionale.
Ciò ha fatto sì che il campo diventasse più integrativo con diversi approcci sperimentali o computazionali più comunemente combinati per generare una rappresentazione più dettagliata e accurata dei meccanismi biologici. La generazione di colpi di cristallo è un passo fondamentale per eseguire esperimenti di diffrazione di raggi X a cristallo singolo e per sviluppare tecniche come la micro ED e la cristallografia seriale. Utilizzando metodi di imaging avanzati, UVTBF e SHG insieme alla potenza dell'algoritmo Marco ci aiutano a identificare cristalli utili su tutte le scale di dimensioni.
I nostri metodi di cristallizzazione ad alta produttività hanno generato una grande quantità di dati per sondare domande riguardanti l'efficienza dei componenti del cocktail di cristallizzazione. L'imaging specializzato che facciamo rivela come i metodi ottici non lineari possono essere utilizzati per rilevare cristalli infinitamente piccoli. Trovare le condizioni di cristallizzazione è fondamentale per i metodi strutturali basati sui cristalli, che rappresentano il 90% di tutti i modelli strutturali nella banca dati sulle proteine.
Nel 2021, quasi 2 milioni di file sono stati scaricati al giorno dal PDB, sottolineando l'impatto che le strutture hanno nel preparare la strada a ulteriori indagini scientifiche.
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo di screening di cristallizzazione ad alto rendimento, descrivendo in dettaglio la preparazione di 1.536 piastre di micro-saggio e le successive procedure sperimentali nell'arco di sei settimane. Enfatizza l'uso di tecnologie di imaging avanzate e un'interfaccia grafica utente basata sull'IA per un'analisi efficiente delle condizioni di cristallizzazione delle macromolecole.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia strutturale
- Tecniche di cristallizzazione
- Tecnologie di imaging
Sfondo
- La cristallizzazione è fondamentale per gli esperimenti di diffrazione dei raggi X.
- I metodi di imaging avanzati migliorano il rilevamento di piccoli cristalli.
- La predizione computazionale della struttura ha trasformato la biologia strutturale.
- Condizioni di cristallizzazione efficienti sono essenziali per i modelli strutturali.
Obiettivo dello studio
- Raffinare l'identificazione delle condizioni di cristallizzazione.
- Utilizzare metodi ad alto rendimento per generare "hit" cristallini.
- Integrare le tecnologie di imaging con i protocolli di cristallizzazione.
Metodi utilizzati
- Preparazione di piastre a 1.536 pozzetti con soluzioni di cocktail specifiche.
- Uso di sistemi robotici di manipolazione dei liquidi per un'erogazione precisa.
- Applicazione di tecniche di imaging UV-TPF e SHG.
- Analisi delle immagini di cristallizzazione utilizzando un'interfaccia basata sull'IA.
Principali risultati
- Identificazione di "hit" cristallini su varie scale di dimensione.
- Imaging riuscito di cristalli oscurati dalla precipitazione.
- Dati generati per valutare l'efficienza del cocktail di cristallizzazione.
- Integrazione dell'imaging automatizzato in tutta la timeline sperimentale.
Conclusioni
- I metodi ad alto rendimento migliorano significativamente lo screening di cristallizzazione.
- Le tecniche di imaging avanzate sono cruciali per rilevare piccoli cristalli.
- Gli strumenti basati sull'IA facilitano l'analisi efficiente delle condizioni di cristallizzazione.
