¿Alguna vez te has preguntado por qué cada otoño las hojas de los árboles cambian de verde a tonos amarillos, naranjas y rojos? ¿Qué es lo que le da a las hojas sus colores brillantes en primer lugar? La respuesta está en los orgánulos de las plantas, llamados cloroplastos, que contienen pigmentos que absorben ciertas longitudes de onda de la luz solar y reflejan otras. Un pigmento en particular, la clorofila, es el más abundante en verano. Absorbe longitudes de onda de alta energía, púrpura, azul y rojo de la luz solar, y refleja las longitudes de onda verdes que dan a las hojas su apariencia verde. Hay otros pigmentos en las hojas, como los carotenoides, que reflejan la luz roja y amarilla. En otoño las hojas dejan de reponer sus pigmentos. Dado que la clorofila se degrada más rápido que los otros pigmentos, los colores de estos carotenoides se desenmascaran.
La presencia de diferentes pigmentos en una hoja verde se puede demostrar con papel de cromatografía, un polímero hidrofílico que separa las moléculas en función de su solubilidad en un solvente en particular. Primero, el extracto de hoja se carga en el papel. Cuando el papel se sumerge en un solvente hidrofóbico orgánico, el solvente viaja a lo largo del papel debido a la acción capilar y en el camino separa diferentes pigmentos en el extracto de hoja. Los pigmentos que son más hidrófobos se transportan más arriba en el papel. Mientras que los pigmentos hidrófilos se unen a la celulosa, lo que dificulta su movimiento. Una vez que todos los pigmentos se clasifican por su hidrofobicidad, podemos calcular el factor de retención o los valores de Rf. El valor Rf es la relación entre la distancia recorrida por un pigmento y la distancia recorrida por el disolvente. Cada pigmento tiene un valor Rf único y podemos identificar fácilmente los pigmentos comparando los valores calculados con los estándares. La fotosíntesis, el proceso por el cual las plantas convierten el dióxido de carbono, el agua y la energía luminosa en energía química y oxígeno, se lleva a cabo principalmente en las hojas de una planta, y la clorofila juega un papel fundamental en este proceso. Los cloroplastos contienen docenas de moléculas de clorofila, cada una de las cuales realiza una tarea específica e interactúa de formas complejas. En última instancia, la energía de la luz hace que las moléculas de clorofila cedan electrones que se utilizan en otros procesos metabólicos. Por lo tanto, la clorofila necesita un suministro continuo de electrones para reemplazar los que pierde. Estos electrones de reemplazo provienen de la división de las moléculas de agua en protones, electrones y moléculas de oxígeno. A altas tasas de fotosíntesis, el agua se divide más rápido para reponer electrones y el oxígeno se genera rápidamente.
Este fenómeno nos ayuda a evaluar la tasa de fotosíntesis en el laboratorio simplemente suspendiendo discos de hojas en una solución de bicarbonato donde el bicarbonato actúa como una rica fuente de carbono. Al comienzo del experimento del disco de hojas, los gases son expulsados de los discos de las hojas aplicando presión negativa con un vacío en una jeringa. Los discos de las hojas, con sus gases expulsados, se vuelven más pesados y se hunden hasta el fondo de la solución de bicarbonato cuando se transfieren a un vaso de precipitados. Cuando se lleva a cabo la fotosíntesis, el agua en el medio ambiente se divide para reponer los electrones de clorofila. El oxígeno resultante hace que los discos sean más ligeros, lo que hace que floten hacia la superficie con el tiempo. Los entornos que permiten tasas más altas de fotosíntesis tienen discos que flotan más rápido.
En este laboratorio, primero separará e identificará los pigmentos en las hojas de espinaca utilizando papel de cromatografía. A continuación, evaluará la tasa de fotosíntesis en agua y en solución de bicarbonato con un experimento de disco de hojas.
Cromatografía de pigmentos vegetales
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NOTA: En este experimento separarás pigmentos de hojas de espinaca usando papel de cromatografía. Los pigmentos individuales viajan a lo largo del papel a diferentes velocidades y pueden tener diferentes colores. Al calcular la distancia relativa que recorren los pigmentos, su factor de resolución y compararlos con los valores de la literatura, puede identificar diferentes pigmentos. HIPÓTESIS: En este ejercicio la hipótesis experimental es que habrá múltiples pigmentos dentro de las hojas de espinaca que absorben diferentes longitudes de onda de la luz solar. La hipótesis nula es que solo hay un tipo de pigmento dentro de la hoja de espinaca.
Use un lápiz para hacer una línea a dos centímetros de un extremo del papel de cromatografía.
Luego, coloque un limpiador de pipas horizontalmente sobre la parte superior de un vaso de precipitados limpio de 400 mL.
Coloque el lado marcado con lápiz de la tira de cromatografía en la parte inferior del vaso de precipitados.
A continuación, envuelve el papel alrededor del limpiapipas de modo que el borde inferior apenas toque la parte inferior del vaso de precipitados y luego asegúralo con un clip.
Cuando el papel esté asegurado alrededor del limpiapipas, retírelo del vaso de precipitados y luego coloque una hoja de espinaca seca sobre la línea marcada en el papel de cromatografía.
Haz rodar una moneda sobre la hoja de espinaca a lo largo de la línea del lápiz, yendo y viniendo varias veces y aplicando una presión constante. Cuando se retira la hoja, debe haber una línea verde claramente presente.
A continuación, coloque 8 mL de solvente de cromatografía en el vaso de precipitados.
Baje la tira de cromatografía en el vaso de precipitados para que el borde del papel toque el solvente pero la línea verde no. Ajuste el limpiapipas si es necesario.
Sin perturbar el vaso de precipitados, observe el solvente a medida que sube por el papel y los pigmentos individuales se separan.
Cuando el solvente haya recorrido la mitad del papel de cromatografía, lo que tomará aproximadamente 10 minutos, y los pigmentos se hayan separado en bandas bien definidas, retire el papel del vaso de precipitados.
Marque cuánto viajó el solvente con un lápiz y luego deje que el papel se seque. NOTA: El disolvente se evapora rápidamente.
A continuación, registre el número de bandas visibles y describa su color y tamaño relativo.
Deseche el solvente de cromatografía en un contenedor de residuos debajo de una campana de gases. Tire las tiras de cromatografía a la basura normal y luego limpie los vasos de precipitados con agua y jabón.
Discos de hojas flotantes en el vacío
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NOTA: En este experimento observarás indirectamente la fotosíntesis y la respiración celular utilizando un disco de hojas flotantes en una solución. Durante la fotosíntesis, las burbujas de aire harán que las hojas floten, y durante la respiración, los discos se hundirán. HIPÓTESIS: En este ejercicio, la hipótesis experimental es que los discos foliares tendrán una mayor tasa de fotosíntesis en la solución de bicarbonato, debido a que el bicarbonato proporciona CO2 agregado para alimentar la fotosíntesis, lo que hace que floten más discos foliares. Además, todos los discos se hundirán en condiciones de oscuridad mientras realizan la respiración celular. La hipótesis nula es que no habrá diferencia en la tasa de fotosíntesis, y por lo tanto en el número de discos flotantes, entre el bicarbonato y el agua, o los tratamientos de luz y oscuridad.
Para colocar discos de hojas al vacío, primero retire los émbolos de dos jeringas de 20 mL y luego coloque 10 discos de hojas dentro de cada tubo de jeringa. Etiquete una jeringa como "bicarbonato" y la otra jeringa como "agua".
Reemplace los émbolos y empuje el émbolo hasta que solo quede una pequeña cantidad de aire en la jeringa. Tenga cuidado de no dañar los discos de las hojas.
Introduce 5 mL de la solución de bicarbonato en una de las jeringas. Invierta y gire la jeringa para suspender los discos de las hojas en la solución.
Expulsa la mayor cantidad de aire posible sin expulsar la solución ni dañar los discos de las hojas.
Luego extraiga 5 mL de la solución de agua en la otra jeringa y gírela como se describió anteriormente (paso 3).
Para crear un vacío, sostenga un dedo sobre la punta de la jeringa mientras tira hacia atrás del émbolo. Sostenga esto durante 10 segundos mientras gira la jeringa para mantener los discos de hojas en suspensión.
Luego, suelta el vacío. NOTA: Los discos deberían haber absorbido la solución en los espacios de aire de sus tejidos y debería verlos hundirse. Si los discos no se hunden, puede repetir la creación de vacío hasta tres veces.
A continuación, agregue 50 mL de solución de bicarbonato a un vaso de plástico o un vaso de precipitados de vidrio, y luego agregue suavemente los discos de la jeringa de vacío de bicarbonato.
Para el control, agregue la misma cantidad de agua a una taza idéntica y luego agregue los discos de hojas de la jeringa de vacío de agua. Etiquete los recipientes de manera adecuada.
Coloca ambas tazas bajo una fuente de luz.
Cada cinco minutos registre el número de discos que flotan en la superficie de la copa en la Tabla 3 hasta que hayan pasado 20 minutos. Haga clic aquí para descargar la Tabla 3
A continuación, retire las copas de la fuente de luz y luego gírelas para que los discos de la superficie se mezclen con los gases que también estén en la superficie.
Mueve las tazas a un lugar oscuro. Cada cinco minutos registra el número de discos de hojas que flotan en la superficie hasta que hayan pasado 20 minutos. Gira la taza cada vez antes de volver a colocarla en la oscuridad.
Para limpiar, desecha los discos de hojas en la papelera y vierte la solución de bicarbonato por el desagüe. Lave bien las jeringas y los vasos.
Resultados
NOTA: En el primer experimento, observaste qué tan lejos viajaban los pigmentos de las hojas de espinaca en el papel de cromatografía. Diferentes pigmentos absorben la luz en diferentes longitudes de onda.
Usando bolígrafos o lápices de colores, dibuje las posiciones de las bandas de pigmento y el solvente en la Figura 3.
Calcule el factor de retención, o los valores de Rf para los pigmentos, que se hace dividiendo la distancia a la que el pigmento en cuestión se movió por el papel desde la línea por la distancia que el solvente se movió por el papel desde la línea.
Registre estos datos en la Tabla 1. NOTA: En el segundo experimento, observaste discos de hojas flotando y hundiéndose como una medida indirecta de la fotosíntesis y la respiración.
Grafica los resultados con el tiempo y los minutos en el eje x y el número de discos flotantes en el eje y. Utilice dos líneas diferentes para representar el control del agua y el tratamiento con bicarbonato.
Añade una línea al gráfico para indicar el punto donde los discos fueron retirados de la condición de luz y colocados en la oscuridad.
A continuación, comenzando con la condición de bicarbonato, use el gráfico para determinar el punto en el que flotaba el 50% de los discos de hojas. Esto se conoce como tiempo efectivo, o ET50. NOTA: Notará que es probable que los discos alcancen la marca de flotación del 50% una vez en condiciones de luz y luego nuevamente en condiciones de oscuridad.
Sus muestras de agua pueden o no haber alcanzado la marca ET50. Si lo hicieron, agregue también la línea de este ejemplo.
Por último, compara tus valores y gráficos de ET50 con el resto de la clase.
