Why is SDS used in the DNA isolation lysis buffer?

SDS is a strong anionic detergent that breaks apart cell membranes, allowing cells to lyse and release their DNA. The experiment compares DNA yield from samples prepared with and without SDS to demonstrate how detergent enhances cell membrane disruption and DNA recovery from cheek cells.

What is the purpose of proteinase K in DNA isolation?

Proteinase K is an enzyme that digests proteins associated with DNA, including histones and other cellular proteins. Adding proteinase K and incubating samples at 56°C for 10 minutes helps purify the DNA by removing protein contaminants that would otherwise interfere with downstream analysis.

How does ethanol precipitation isolate DNA from solution?

Ethanol is a nonpolar solvent that causes DNA to become insoluble and precipitate out of the aqueous solution. When 100% ethanol is carefully layered over the cell lysate, stringy DNA precipitate forms at the interface between the ethanol and aqueous layers, allowing visual isolation and collection of the DNA.

What does a restriction enzyme digest reveal about DNA structure?

Restriction enzymes cut DNA at specific recognition sequences, producing fragments of predictable sizes. By comparing virtual digests to actual gel results, students can verify enzyme specificity and understand how restriction enzyme analysis identifies DNA sequences and creates unique banding patterns for DNA profiling.

Why are different buffers required for different restriction enzymes?

Restriction enzymes have optimal pH and salt conditions for catalytic activity. StuI works optimally in buffer 2.1 or CS buffer, while BsrGI performs best in buffer 2.1 or buffer 3.1. Using the correct buffer ensures maximum enzyme efficiency and accurate DNA digestion results during restriction enzyme analysis.

How does gel electrophoresis separate DNA fragments by size?

DNA fragments migrate through an agarose gel matrix when an electric current is applied, with smaller fragments moving faster toward the positive electrode than larger ones. After staining with SYBR Safe dye and UV visualization, distinct bands appear representing DNA fragments of different sizes, allowing comparison between single and double enzyme digests.

What does combining two restriction enzymes in a single digest demonstrate?

Using both StuI and BsrGI together produces more DNA fragments than either enzyme alone, demonstrating additive cutting at different recognition sites. The virtual digest with both enzymes yields 12 bands compared to 7 for StuI and 6 for BsrGI, illustrating how multiple restriction sites create unique DNA profiles for identification purposes.

Análisis de enzimas de restricción y aislamiento de ADN

Conceptos Preparación del instructor Protocolo del estudiante

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La extracción de ADN es la eliminación y purificación del ADN de las células. En primer lugar, las células se lisan, se rompen, generalmente a través de una combinación de alteración física y tratamiento con productos químicos, como un detergente que disuelve la célula y las membranas nucleares. El SDS o dodecil sulfato de sodio es un detergente de uso común que funciona solubilizando las proteínas y lípidos que forman estas membranas. A continuación, el contenido puede flotar libremente en la solución circundante.

A continuación, el ADN debe separarse de las otras moléculas presentes. La proteinasa K añadida a la reacción romperá los enlaces peptídicos y digerirá las proteínas contaminantes. A continuación, se añade sal a la muestra, que estabiliza los grupos fosfato cargados negativamente en la columna vertebral del ADN y, tras la adición de alcohol helado, precipita el ADN fuera de la solución. El precipitado blanco se recoge haciéndolo girar en una centrífuga donde se deposita en el fondo del tubo. Después de lavarlo y volver a suspenderlo en una solución tampón, el ADN extraído finalmente se puede utilizar en aplicaciones de investigación o biotecnología.

Algunas aplicaciones de la biotecnología, como la toma de huellas dactilares del ADN, que puede identificar nuevos patrones en el ADN específicos de un individuo o individuos, implican el uso de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son moléculas que interactúan con el ADN y reconocen secuencias específicas. Una vez que se identifica su sitio específico, cortan el ADN. Esto dará como resultado que la hebra se corte en una o más piezas lineales. Si el ADN extraído era un plásmido, una pieza circular de ADN que se encuentra con mayor frecuencia en las bacterias, cualquier corte dará como resultado que el ADN forme un fragmento o fragmentos lineales. Diferentes enzimas de restricción reconocen diferentes secuencias de ADN, por lo que el uso de una combinación de estas puede resultar en la producción de fragmentos distintos.

En la toma de huellas dactilares de ADN, podemos examinar estos fragmentos utilizando una técnica llamada electroforesis de ADN o electroforesis en gel. Para preparar geles, la agarosa en polvo se mezcla con un tampón y se calienta hasta que se disuelve. A continuación, se añade una tinción de nucleótidos a la mezcla tibia y luego esta solución se vierte en el molde de fundición. Se inserta un peine para formar los pozos. Cuando se solidifica, el gel se transfiere a una caja de gel llena de tampón y se retira el peine. Una mezcla de referencia de fragmentos de ADN teñidos de longitudes conocidas, la escalera de ADN, se añade a un pocillo y las muestras de ADN teñido de interés se cargan en los pocillos restantes. La caja está conectada a una fuente de alimentación y el encendido induce la migración de los grupos fosfato cargados negativamente en los nucleótidos de ADN a través del gel hacia el ánodo, el extremo positivo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente que los fragmentos más grandes, que migran con dificultad.

Cuando se completa la ejecución, el gel se expone a luz ultravioleta para visualizar la tinción de nucleótidos en las muestras de ADN. Su presencia se puede confirmar en función de su ubicación relativa a las bandas de la escalera. Debido a que el ADN con diferentes secuencias tendrá sitios de corte en diferentes ubicaciones, esto puede producir nuevos patrones de bandas, o huellas dactilares, que se pueden usar para distinguir individuos o perfiles de ADN variantes.

En este laboratorio, realizará extracciones de ADN utilizando un tampón con y sin SDS para evaluar la importancia de los detergentes en el aislamiento del ADN y, a continuación, digerirá el ADN plásmido con diferentes enzimas de restricción para examinar los perfiles de ADN resultantes.

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Aislamiento de ADN ul class="lab-items">
NOTA: En este experimento realizarás el aislamiento de ADN bajo dos condiciones experimentales: una usando un tampón que contiene el detergente SDS y otra sin detergente. Hipótesis: La hipótesis alternativa para este experimento podría ser que la muestra preparada sin SDS, un detergente aniónico fuerte que rompe las membranas celulares, producirá menos ADN que la muestra preparada con SDS. La hipótesis nula para este experimento podría ser que ambas muestras producirán una cantidad igual de ADN.
Para empezar, recoge una muestra de tejido para el aislamiento de ADN. Aquí usarás tus propias células de mejilla. Use un palito de paleta para raspar el interior de sus mejillas durante aproximadamente 30 s. IMPORTANTE: No raspe lo suficientemente fuerte como para causar dolor o extraer sangre.
Coloque un embudo en un tubo cónico de 15 mL.
Luego tome 10 mL de la solución salina al 1% que se le proporciona en un vaso etiquetado y agítelo en su boca sin tragar.
Continúe agitando durante 90 s y luego escupa la solución salina que contiene las células de sus mejillas en el embudo para recogerla en el tubo cónico.
A continuación, etiquete dos tubos de microcentrífuga vacíos con sus iniciales.
Etiquete uno de los tubos como +SDS y el otro como -SDS para diferenciar los dos tratamientos.
Luego agregue de 1.5 a 2 mL de la solución salina que contiene las células de la mejilla a cada tubo.
Haga girar los tubos en una microcentrífuga durante 30 s.
Retire los tubos de la microcentrífuga y vierta cuidadosamente el sobrenadante sin alterar las células recogidas en el fondo de cada tubo.
Llene los tubos con más solución salina que contiene las células de la mejilla y repita la centrifugación.
Repita este proceso teniendo cuidado de distribuir uniformemente las células entre los tubos +SDS y -SDS hasta que se hayan recogido todas las células de la mejilla.
A continuación, agregue 1 mL de tampón de lisis que contenga SDS al tubo marcado como +SDS, y luego vuelva a suspender el pellet de celda pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Luego agregue 1 mL de tampón de lisis sin SDS al tubo marcado con -SDS y vuelva a suspender el pellet de celda pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Después de esto, agregue 10 μL de proteinasa K a cada tubo y luego coloque cuidadosamente los tubos en el baño de agua a 56 ºC durante 10 min.
Después de 10 minutos, retire cuidadosamente los tubos del baño de agua y agregue 100 μL de NaCl 2.5 M a cada tubo.
Cierra los tubos firmemente e invierte varias veces para mezclar.
A continuación, etiquete un tubo cónico de 15 mL como +SDS y otro con -SDS.
Vierta el contenido de cada tubo de microcentrífuga en el tubo cónico de 15 mL correspondiente.
Obtenga una alícuota de 10 mL de etanol 100% del congelador.
Sostenga uno de los tubos cónicos en ángulo y dispense lentamente 1 mL de etanol al 100% en el tubo para formar una capa encima del líquido que ya está en el tubo.
Repita este proceso para el segundo tubo cónico.
Ahora mira tus dos tubos. Debe haber un precipitado fibroso presente en la interfaz del etanol y la capa acuosa debajo de él. Este material fibroso contiene el ADN aislado. Tome fotografías del ADN en el tubo y tome notas descriptivas claras y dibujos de sus observaciones en su cuaderno.
Usando una varilla de agitación de vidrio, recoge el ADN del tubo +SDS y examínalo. Repita esto para el tubo -SDS, registrando nuevamente sus observaciones. Tome nota de si uno de los tubos parece tener más precipitado que el otro, y por qué podría ser así.
Finalmente, deseche todos los residuos líquidos en el contenedor de residuos apropiado y devuelva todas las herramientas a sus ubicaciones adecuadas en el laboratorio.
Restricción, Enzima, Compendio Virtual ul class="lab-items">
Para estudiar cómo funcionan las enzimas de restricción, primero navega al sitio web de New England Biolabs: https://www.neb.com/
Los recursos disponibles en este sitio permiten a los investigadores realizar experimentos virtuales antes de que se realicen en el laboratorio. Haga clic en "Herramientas y recursos" para encontrar la herramienta NEBcutter y abrir el programa.
A la derecha del cuadro de búsqueda encuentra la lista que dice "Viral + fago". En esa lista, seleccione Lambda. Este es el nombre del ADN que vas a digerir. Seleccione la opción Lineal donde la herramienta dice "la secuencia es" y la opción "Enzimas NEB" donde la herramienta dice "Enzimas a usar". A continuación, haga clic en Enviar.
La página siguiente mostrará un mapa de restricción completo del ADN lambda. Este mapa de restricción se puede usar para predecir lo que sucederá si se usan ciertas enzimas. A continuación, haga clic en "Resumen personalizado" bajo el encabezado "Opciones principales".
Busque la enzima StuI y observe que funciona de manera óptima en el tampón 2.1 o en el tampón CS. Seleccione la enzima StuI y haga clic en digerir.
En la siguiente ventana, haga clic en "Ver gel" debajo del encabezado "Opciones principales". Seleccione la opción para ejecutar un gel virtual del 1 % con un resumen pBR322-BstN1.
Después de que aparezcan los resultados, haz una captura de pantalla y pégala en un documento en blanco.
Después de esto, vuelva a la página principal de la herramienta NEBcutter y seleccione "Nuevo resumen personalizado".
Esta vez busque la enzima BsrGI y observe que funciona de manera óptima en el tampón 2.1 o en el tampón 3.1. Seleccione la enzima y haga clic en digerir.
Bajo el encabezado de opciones principales, haga clic en "Ver gel" y seleccione las opciones para ejecutar un gel virtual al 1% utilizando un resumen pBR322-BstN1.
Tome una captura de pantalla de los resultados y guárdela en un documento de texto.
Finalmente, repita estos pasos usando StuI y BsrGI juntos en un solo resumen.
De nuevo, haz una captura de pantalla y guarda el gel resultante.
Perfilado de ADN
- Antes de comenzar los digieres enzimáticos de restricción, primero coloque sus alícuotas de ADN lambda, tampón NEB 2.1, enzima StuI y enzima BsrGI en un cubo de hielo, y llévelo a su área de trabajo.
- Etiquete un tubo como StuI - esto contendrá el resumen de StuI.
- Etiqueta un tubo como BsrGI para que contenga el resumen de BsrGI.
- Luego, etiquete un tubo S+B, para contener el digesto con ambas enzimas.
- Utilice los micropipetes apropiados para configurar las reacciones enumeradas en la Tabla 1:Haga clic aquí para descargar la Tabla 1
- Primero, pipetea los 40 μL de agua en cada tubo.
- Luego, utilizando una punta de pipeta nueva cada vez, dispense 5 μL de tampón 2.1 en cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
- A continuación, agregue 4 μL de ADN lambda a cada tubo, y luego pipetee 0.5 μL de cada enzima en los tubos apropiados.
- Finalmente, agregue una cantidad suficiente de agua a cada tubo para aumentar el volumen total hasta 50 μL.
- A continuación, incube los tubos a 37 ºC durante 15 - 60 min en un baño de agua, y devuelva los tampones y las enzimas al congelador.
- Para preparar un gel de agarosa para hacer la digestión, en un matraz de 250 mL mezcle 1 g de polvo de agarosa con 100 mL de tampón TAE.
- Calienta la solución en el microondas durante aproximadamente 90 s a plena potencia, teniendo cuidado de evitar que la solución se desborde.
- A continuación, retire cuidadosamente la solución del microondas con un guante o una almohadilla térmica y colóquela enfriar durante unos 15 min.
- Mientras la solución de agarosa se enfría, instala una bandeja de fundición.
- Cuando la solución de agarosa esté fría, agregue 5 μL de tinción de gel SYBR Safe 10,000X a la solución.
- Agregue el peine que se usa para hacer los pocillos del gel a la bandeja de fundición del aparato de electroforesis en gel.
- Vierta la solución de gel de agarosa en la bandeja de fundición y deje que se solidifique.
- Una vez que el gel esté sólido, tire del peine hacia arriba para quitarlo del gel, y luego retire los diques de la bandeja de fundición si corresponde.
- Coloque el gel en la cámara de electroforesis con los pocillos colocados más cerca del electrodo negativo o negro y llene la cámara con 1x tampón TAE para cubrir completamente el gel.
- Retira tus muestras del baño de agua.
- Luego agregue 8.3 μL de tinte de carga 6X a cada muestra.
- Dispense 10 μL del digesto pBR322-BstN1 que contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido en el primer pocillo.
- Luego cargue 25 μL de muestra StuI en el segundo pocillo.
- Coloque 25 μL de muestra BsRGI en el tercer pocillo.
- Cargue 25 μL de muestra S+B en el cuarto pocillo.
- Para hacer funcionar el gel, conecte los cables a la cámara de electroforesis y luego a la fuente de alimentación. El cable rojo positivo debe estar en el extremo más alejado de los pozos y el plomo negro negativo debe estar más cerca de los pozos. Esto se debe a que las muestras van de negativo a positivo.
- Encienda la fuente de alimentación y configure la caja de gel para que funcione a 170 voltios durante aproximadamente 60 minutos.
- Una vez finalizada la carrera, apague la caja de gel y desconecte los electrodos del tanque.
- Luego retire el gel de la cámara de electroforesis y obsérvelo con un transiluminador UV. PRECAUCIÓN: Proteja los ojos de los rayos UV usando gafas protectoras o usando el protector provisto.
- Finalmente, use la cámara de un teléfono celular para tomar una foto del gel directamente desde arriba y en paralelo a la superficie del gel.
Resultados
- Compara el gel que has utilizado en el laboratorio con tu digesto enzimático virtual con StuI.
- El resumen virtual con StuI resultó en siete bandas. Cuente las bandas en el carril StuI de su gel y observe si coincidió con el resumen virtual o si parecía mostrar un patrón similar. NOTA: Las bandas pequeñas en los geles de electroforesis de agarosa a menudo son invisibles.
- Ahora mira los resultados de tu resumen de BsrGI. El compendio virtual con BsrGI dio como resultado seis bandas. Cuente las bandas en el carril BsrGI. Una vez más, observe si el resumen virtual y el resumen de laboratorio mostraron el mismo patrón o uno similar.
- Por último, mire el resumen virtual con StuI y BsrGI. El digestión virtual con ambas enzimas dio como resultado 12 bandas. Cuente las bandas en el carril correspondiente de su gel y considere si el patrón de bandas de ADN se parece al digesto virtual.