Actividad enzimática
- Experimento de Enzima Peroxidasa de Referencia ul class="lab-items">
- Para empezar, se debe determinar la línea de base para la reacción de la enzima peroxidasa. Haga el sustrato agregando 7 mL de agua destilada a un tubo de ensayo limpio y luego agregue 0.2 mL de guayacol. Nota: El guaiacol es un indicador que cambia de color y se vuelve más amarillo-anaranjado a medida que avanza la reacción enzimática.
- A continuación, agregue 0.3 mL de 0.1% H2O2.
- Usando un marcador, etiquete el sustrato del tubo de ensayo y luego cubra el tubo con un trozo de película de sellado.
- Sosteniendo la tapa en su lugar, invierta el tubo cuatro veces para mezclar el contenido del tubo.
- En un segundo tubo de ensayo, agregue 6.0 mL de agua destilada y 1.5 mL de peroxidasa de nabo y etiquete este tubo como "Enzima".
- Cubra este tubo con un nuevo trozo de película de sellado y mezcle estas soluciones mediante cuatro inversiones como se describió anteriormente (paso 4).
- Cuando ambos tubos se hayan mezclado, coloque un temporizador en el banco, junto al estante de tubos de ensayo, luego vierta el contenido del tubo de sustrato en el tubo de enzimas, teniendo cuidado de no derramar ningún líquido.
- A continuación, vierta todo el volumen del tubo de enzimas de nuevo en el tubo de sustrato para mezclar completamente las soluciones y cubrir el tubo de sustrato con otro trozo de película de sellado.
- Coloque el tubo de ensayo en la rejilla y ponga en marcha el temporizador.
- Observe el color en el tubo de sustrato a los 0, 1, 2, 3, 4 y 5 minutos, después de la mezcla.
- Para cuantificar el cambio relativo en el color y la velocidad de la reacción, haga coincidir el color observado con el color más cercano en el estándar. NOTA: Tomar una foto de la intensidad de color observada en cada punto de muestra puede facilitar el registro de los resultados.
- Registra los colores que ves en la tabla. Haga clic aquí para descargar la Tabla 1
- Investigando el efecto del pH en la actividad de la peroxidasa
- HIPÓTESIS: En este ejercicio, la hipótesis experimental es que la velocidad de reacción alcanzará un máximo u óptimo a un pH neutro de rango medio y que estas tasas serán más altas o aproximadamente iguales a la tasa de referencia. La hipótesis nula es que no habrá diferencias en las velocidades de reacción entre los tratamientos de referencia y los de pH.
- Primero, etiquete seis tubos de ensayo limpios para cada uno de los seis niveles de tampón de pH 3 - 8 y la palabra "Enzima".
- A continuación, agregue 6 mL de las correspondientes soluciones tampón de pH proporcionadas por su instructor a cada uno de los tubos de ensayo.
- Luego, agregue 1.5 mL de peroxidasa de nabo a cada tubo, teniendo cuidado de no contaminar el gotero con la solución tampón.
- Cubra los tubos de enzimas con una película de sellado e invierta suavemente cada tubo para mezclar el contenido del tubo.
- Como se describe en el experimento de reacción de referencia, haga los sustratos para estas reacciones agregando 7 mL de agua destilada, 0.2 mL de guayacol y 0.3 mL de 0.1% H2O2 a seis tubos de ensayo limpios nuevos.
- A continuación, etiquete seis tubos de ensayo limpios adicionales con los niveles de pH 3 - 8 y la palabra "Solución" y prepare un temporizador.
- Trabajando rápidamente, vierta un tubo de sustrato y un tubo de pH en el tubo de solución correspondiente. Repita este paso para cada uno de los diferentes niveles de pH.
- Luego, cubra los tubos con película de sellado y mezcle cada tubo con cuatro inversiones. Coloque cada tubo en una rejilla de tubos, a medida que se mezclan.
- Observa el color en cada tubo en el tiempo 0 e inmediatamente inicia el temporizador. Continúe observando el color en cada tubo en cada intervalo de minutos, hasta 5 minutos.
- En cada intervalo, use el código de color en el estándar para registrar los colores observados en su tabla.
- Investigando el efecto de la temperatura en la actividad de la peroxidasa
- HIPÓTESIS: En este ejercicio, la hipótesis experimental es que la velocidad de reacción alcanzará un óptimo por encima de la temperatura ambiente, o 23 °C, pero por debajo de la tasa de desnaturalización de la enzima y que este máximo será mayor que la tasa basal. La hipótesis nula es que no habrá diferencias en las velocidades de reacción entre los tratamientos de referencia y los de temperatura.
- Llena un vaso de precipitados de 800 ml hasta la mitad con hielo y vierte agua fría en el vaso de precipitados para crear un baño de hielo. Etiquete este vaso de precipitados como "Hielo".
- Luego, etiquete cuatro nuevos vasos de precipitados de 600 mL con las mismas temperaturas que sus tubos de sustrato y agregue 150 mL de agua del grifo a cada uno.
- Usando una placa caliente y un termómetro, lleve los vasos a 25, 35, 45 y 60 °C, según sus etiquetas.
- Prepare cinco pares más de sustrato y tubos de enzimas, como se describe para la reacción de referencia, utilizando agua destilada en el tubo de enzimas, en lugar de un tampón de pH.
- Etiquete los tubos de sustrato como "Hielo", "25 °C", "35 °C", "45 °C" y "60 °C".
- Cuando todos los baños de agua hayan alcanzado sus temperaturas adecuadas, mezcle el sustrato y las soluciones enzimáticas vertiendo primero el contenido de cada tubo de sustrato en un tubo de enzimas y luego vertiendo el contenido del tubo de enzimas nuevamente en el tubo de sustrato.
- Cubre los tubos de sustrato con película de sellado y observa los colores en el tiempo 0.
- Luego, coloque los tubos en sus correspondientes baños de precipitados, según la etiqueta de temperatura que se le dio a cada tubo e inicie un temporizador.
- Para cada intervalo de 1 minuto, retira los tubos del agua y registra su color, usando el stabdard como referencia.
- Luego, colócalos en sus baños hasta que se haya registrado cada punto de tiempo, hasta 5 minutos.
- Resultados
- Para determinar la línea de base para la reacción, grafica el cambio en la intensidad del color en función del tiempo. NOTA: El número de unidades que aumentó el color durante el período de tiempo de 5 minutos servirá como la tasa de reacción de referencia para la comparación relativa.
- Ahora grafica la diferencia en la intensidad del color contra los niveles de pH utilizados en el primer experimento.
- Agregue la línea de base para comparar y luego determine si la velocidad de reacción óptima fue mayor, menor o igual que la línea de base.
- Usando este gráfico, determine el pH óptimo para la reacción. Nota: Es posible que la reacción no ocurra a todos los pH. El pH óptimo para la enzima peroxidasa suele estar en el rango de 6 a 7. Al exponer la enzima a un sustrato con diferentes niveles de pH, notará una disminución en la velocidad de reacción a medida que el pH de la enzima se vuelve más básico, lo que hace que la enzima sea más inestable.
- Finalmente, grafica la diferencia en la intensidad del color a lo largo del tiempo para las diferentes temperaturas utilizadas en el segundo experimento, utilizando la misma línea de base para la comparación.
- Usando este gráfico, determine la temperatura óptima para la reacción y compárela con la línea de base. NOTA: Es posible que la reacción no ocurra a todas las temperaturas. En este experimento, la reacción parece más eficiente alrededor de 45 °C, y por encima de esto, la enzima peroxidasa comienza a desnaturalizarse. Por esta razón, no debería producir un cambio de color en el vaso de precipitados a 60 °C. La velocidad de reacción también se ralentizará o se detendrá en el baño de hielo, ya que no hay suficiente energía para que la enzima catalice la reacción.