Cromatografía en columna

La cromatografía en columna es una técnica que utiliza una columna empaquetada para separar compuestos en función de sus interacciones con una fase estacionaria, que suele ser en forma de perlas microscópicas. Los espacios entre las cuentas se rellenan con disolvente. La apertura de la columna permite que el solvente fluya a través de la fase estacionaria. Cuando se aplica una mezcla a la parte superior de la columna empaquetada seguida de una mayor cantidad de solvente, la mezcla pasa a la fase móvil y fluye a través de la fase estacionaria.

Cada componente de la mezcla interactúa con la fase estacionaria de una manera diferente. Algunos componentes tienen interacciones débiles con la fase estacionaria y, por lo tanto, se mueven rápidamente a través de la columna, mientras que otros tienen interacciones fuertes con la fase estacionaria y, por lo tanto, se mueven más lentamente. Esto separa los diferentes compuestos en bandas, que se recogen en pequeñas fracciones. Esto permite la purificación de cada compuesto.

Entonces, ¿qué tipo de propiedades se pueden utilizar para separar mezclas? Una de las propiedades más utilizadas es la polaridad. Para ello, el gel de sílice, que es una forma de dióxido de silicio, se utiliza a menudo como fase estacionaria. El gel de sílice interactúa con los compuestos mediante interacciones dipolo-dipolo y enlaces de hidrógeno a través de los grupos -OH que se forman en su superficie. Por lo tanto, los compuestos polares interactuarán fuertemente con la fase estacionaria, mientras que los compuestos no polares interactuarán débilmente.

Otras propiedades que se pueden aprovechar para la separación incluyen el tamaño, la carga y la hidrofobicidad. Una forma común de cargar la fase estacionaria en la columna es como una suspensión de la fase estacionaria y solvente. Luego, la fase estacionaria se empaqueta haciendo fluir más solvente a través de la columna para compactar la suspensión. Es esencial que la fase estacionaria se llene de manera uniforme, sin burbujas de aire, canales vacíos o parches secos. Estos pueden interrumpir el flujo y causar la mezcla de bandas.

Al elegir una columna, el diámetro se basa en el volumen de la muestra que se va a separar. La muestra debe cubrir la parte superior de la columna con una capa delgada y uniforme. Una capa de muestra más gruesa conduce a bandas más anchas. La longitud de la columna depende de lo bien que se separen los compuestos en la fase estacionaria. Los compuestos con afinidades similares por la fase estacionaria requieren una columna larga para una separación adecuada. Sin embargo, una mezcla de compuestos con afinidades muy diferentes para la fase estacionaria se puede separar en una columna más corta.

En este laboratorio, explorará la cromatografía en columna empaquetando y preparando primero una columna de gel de sílice. Luego, usará su columna para separar los componentes coloreados en colorante alimentario verde.