What is the purpose of the sand layer in column chromatography?

The sand layer, placed 0.5 cm above the cotton plug, prevents silica gel from passing through the plug into your collected fractions. This protective barrier ensures that only the separated dyes are collected in pure fractions, maintaining the integrity of your samples throughout the separation process.

Why does column chromatography use two different eluents for separating food dyes?

Using ethanol first elutes erioglaucine, which has lower affinity for silica gel, while water elutes tartrazine more effectively due to its higher polarity. This two-solvent approach saves time and minimizes solvent waste while maintaining fraction purity, compared to using a single eluent throughout the entire separation.

How do you prepare the silica gel slurry for column chromatography?

Weigh 5 grams of silica gel powder and mix it with 18 mL of 95% ethanol in a beaker. Stir with a glass rod until the texture is consistent and resembles batter with no dry patches or clumps. The slurry should flow easily to avoid clogging the funnel or trapping air bubbles in the column.

What flow rate should you maintain when eluting dyes through the column?

Adjust the stopcock so the solvent level decreases approximately 1 mL every 15 to 20 seconds. Maintain at least 1 cm of solvent above the silica gel at all times by periodically refilling the column. This controlled solvent flow rate ensures proper separation and prevents band broadening during the elution process.

How do you apply the green food dye to the silica gel column?

Use a clean pipette to gently apply 5 to 7 drops of the dye solution evenly across the top of the silica gel. If necessary, add a few drops of ethanol to keep the silica gel covered. Allow the dye to soak in before beginning the elution process with your chosen eluent.

What do the different colors of fractions tell you about dye affinity for silica gel?

The blue erioglaucine elutes with ethanol, indicating lower affinity for silica gel, while yellow tartrazine requires water, indicating higher affinity. This separation demonstrates that tartrazine binds more strongly to silica gel than erioglaucine does, which is why different solvents are needed to elute each dye effectively.

Why is it important to avoid stopping the column chromatography for extended periods?

Stopping for more than 1 minute at a time causes compound bands to start broadening, which reduces separation quality and makes it harder to collect pure fractions. Continuous flow maintains sharp band definition and ensures efficient separation of the dyes throughout the elution process.

Cromatografía en columna

Conceptos Preparación del instructor Protocolo del estudiante

0 vistas03:07 min

La cromatografía en columna es una técnica que utiliza una columna empaquetada para separar compuestos en función de sus interacciones con una fase estacionaria, que suele ser en forma de perlas microscópicas. Los espacios entre las cuentas se rellenan con disolvente. La apertura de la columna permite que el solvente fluya a través de la fase estacionaria. Cuando se aplica una mezcla a la parte superior de la columna empaquetada seguida de una mayor cantidad de solvente, la mezcla pasa a la fase móvil y fluye a través de la fase estacionaria.

Cada componente de la mezcla interactúa con la fase estacionaria de una manera diferente. Algunos componentes tienen interacciones débiles con la fase estacionaria y, por lo tanto, se mueven rápidamente a través de la columna, mientras que otros tienen interacciones fuertes con la fase estacionaria y, por lo tanto, se mueven más lentamente. Esto separa los diferentes compuestos en bandas, que se recogen en pequeñas fracciones. Esto permite la purificación de cada compuesto.

Entonces, ¿qué tipo de propiedades se pueden utilizar para separar mezclas? Una de las propiedades más utilizadas es la polaridad. Para ello, el gel de sílice, que es una forma de dióxido de silicio, se utiliza a menudo como fase estacionaria. El gel de sílice interactúa con los compuestos mediante interacciones dipolo-dipolo y enlaces de hidrógeno a través de los grupos -OH que se forman en su superficie. Por lo tanto, los compuestos polares interactuarán fuertemente con la fase estacionaria, mientras que los compuestos no polares interactuarán débilmente.

Otras propiedades que se pueden aprovechar para la separación incluyen el tamaño, la carga y la hidrofobicidad. Una forma común de cargar la fase estacionaria en la columna es como una suspensión de la fase estacionaria y solvente. Luego, la fase estacionaria se empaqueta haciendo fluir más solvente a través de la columna para compactar la suspensión. Es esencial que la fase estacionaria se llene de manera uniforme, sin burbujas de aire, canales vacíos o parches secos. Estos pueden interrumpir el flujo y causar la mezcla de bandas.

Al elegir una columna, el diámetro se basa en el volumen de la muestra que se va a separar. La muestra debe cubrir la parte superior de la columna con una capa delgada y uniforme. Una capa de muestra más gruesa conduce a bandas más anchas. La longitud de la columna depende de lo bien que se separen los compuestos en la fase estacionaria. Los compuestos con afinidades similares por la fase estacionaria requieren una columna larga para una separación adecuada. Sin embargo, una mezcla de compuestos con afinidades muy diferentes para la fase estacionaria se puede separar en una columna más corta.

En este laboratorio, explorará la cromatografía en columna empaquetando y preparando primero una columna de gel de sílice. Luego, usará su columna para separar los componentes coloreados en colorante alimentario verde.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuente: Lara Al Hariri y Ahmed Basabrain en la Universidad de Massachusetts Amherst, MA, EE.UU

de colorante alimentario
En este experimento, utilizará la cromatografía en columna para separar el colorante alimentario verde en sus colorantes azules y amarillos componentes, llamados erioglacina y tartrazina. En primer lugar, utilizarás un 95% de etanol para eluir el tinte con una afinidad más débil por el gel de sílice. Luego, enjuagarás el segundo tinte de la columna con agua. Para recuperar los tintes purificados, recogerás cada banda de tinte a medida que salga de la columna. Estos volúmenes recolectados se denominan fracciones.
- Para empezar, ponte una bata de laboratorio, gafas de seguridad y un par de guantes de nitrilo.
- Lleva una columna o bureta a la zona central de suministros. Consigue un pedazo de algodón o lana de vidrio y presiónalo en la parte superior de la columna. Use un alambre o varilla larga y de punta roma para empujarlo hacia abajo y tapar la columna justo encima de la llave de paso. nota: El algodón debe ser estable, pero no lo compactes demasiado densamente, porque el solvente debe atravesarlo fácilmente. Asegúrese de que la llave de paso pueda girar libremente sin engancharse en el enchufe.
- Fije una abrazadera de bureta a un soporte de laboratorio y sujete la columna en posición vertical con aproximadamente 4 pulgadas de espacio debajo de ella. Asegúrese de que la llave de paso esté cerrada.
- Etiqueta un vaso de precipitados de 100 ml como 'residuo' y colócalo debajo de la columna.
- A continuación, mida 1 g de arena en un bote de pesaje tarado y llévelo de vuelta al banco.
- Luego, marca la columna unos 0,5 cm por encima de la parte superior del tapón de algodón.
- Coloque un pequeño embudo en la parte superior de la columna y vierta suficiente arena a través del embudo para que haya una capa de 0,5 cm de profundidad sobre el tapón. Esto evitará que el gel de sílice pase a través del tapón a las fracciones.
- Retira el embudo y golpea suavemente la columna para distribuir uniformemente la arena.
- Ahora, prepara tus eluyentes. Etiquete un vaso de precipitados de 50 ml y un cilindro graduado de 50 ml como "agua".
- Mida 50 mL de agua desionizada con el cilindro graduado y viértalo en el vaso de precipitados.
- Luego, etiquete otro vaso de precipitados de 50 ml y un cilindro graduado de 50 ml como 'etanol'. Mida 50 ml de etanol al 95% y viértalo en este vaso de precipitados.
- Ahora, obtenga 4 o 5 pipetas Pasteur limpias y una pera de pipeta. Pipetear suavemente 7 – 8 mL de etanol a lo largo de las paredes internas de la columna. Esta capa de solvente le permitirá verter esta suspensión de gel de sílice en la columna sin perturbar la arena.
- Abra la llave de paso y drene ~1 mL de etanol en el vaso de precipitados para enjuagar el aire de la llave de paso y confirmar que el solvente fluye fácilmente a través del tapón. Asegúrese de que no haya parches secos en la arena y el tapón y golpee suavemente el costado de la columna para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
- A continuación, coloque un embudo limpio en la parte superior de la columna y etiquete un tercer vaso de precipitados de 50 ml como 'lodo de gel de sílice en etanol'.
- Pesa cuidadosamente 5 g de polvo de gel de sílice y viértelo en tu vaso de precipitados etiquetado.
- Luego, lleve el gel de sílice, una varilla de vidrio y su cilindro graduado de etanol a la campana dispensadora de etanol.
- Mida 18 mL de etanol al 95% y viértalo en el vaso de precipitados. Revuelva la mezcla con la varilla de vidrio hasta que la textura sea consistente y no queden parches secos ni grumos de polvo. Esto generalmente toma ~ 1 min. Nota: La lechada debe ser espesa, como la masa, pero aún así debe fluir fácilmente. Si la lechada es demasiado rígida, podría obstruir el embudo o atrapar burbujas de aire en la columna.
- Una vez que el polvo esté completamente suspendido en etanol, llévelo a su banco. Remueve la lechada hasta que su textura vuelva a ser consistente y viértela inmediatamente en la columna.
- Golpea suavemente los lados de la columna mientras el gel de sílice se asienta para eliminar las burbujas de aire.
- Enjuague el vaso de precipitados con 1 o 2 mL de etanol y vierta el enjuague en la columna. Luego, retira el embudo y déjalo a un lado.
- Pipetea etanol a lo largo del interior de la columna para eliminar las partículas adheridas a las paredes. Luego, drena el solvente hasta que el menisco esté apenas por encima de la parte superior del gel de sílice.
- Ahora, use un cilindro graduado de 5 o 10 mL para obtener aproximadamente 0.8 mL de la solución de colorante alimentario verde.
- Utilice una pipeta limpia para aplicar suavemente de 5 a 7 gotas de la solución de tinte de manera uniforme en la parte superior del gel de sílice. Si es necesario, agregue unas gotas de etanol para mantener cubierto el gel de sílice.
- Mientras esperas a que el tinte se absorba, etiqueta dos vasos de precipitados limpios de 50 ml como 'fracción de etanol' y 'fracción de agua'. Cambie el vaso de precipitados de residuos debajo de la columna con el vaso de precipitados de fracción de etanol.
- A continuación, llene la columna con etanol, pipeteando los primeros mL a lo largo de las paredes internas para evitar alterar el gel de sílice.
- Luego, abra la llave de paso hasta la mitad y ajústela hasta que el nivel de solvente disminuya ~1 mL cada 15 – 20 s.
- Rellene periódicamente la columna para mantener el flujo de etanol. Asegúrese de que haya al menos 1 cm de disolvente por encima del gel de sílice en todo momento.
- Monitorea las bandas amarillas y azules a medida que se separan. nota: Si necesita alejarse, cierre la llave de paso para que la columna no se seque mientras no está. Evite detenerse durante más de 1 minuto a la vez porque las bandas compuestas comenzarán a ensancharse. Por lo general, el tinte que se mueve más rápido tarda entre 20 y 35 minutos en salir de la columna.
- Una vez que haya recogido todo el tinte que se mueve más rápido en el vaso de precipitados de fracción de etanol, cierre la llave de paso, deje la fracción de etanol a un lado y coloque el vaso de precipitados de residuos debajo de la columna.
- Drena el solvente hasta que el menisco esté justo por encima de la parte superior del gel de sílice. A continuación, cambie el vaso de precipitados de residuos por el vaso de precipitados de fracción de agua.
- Utilice una pipeta limpia para llenar la parte superior de la columna con agua desionizada. Luego, abra la llave de paso lo suficiente como para permitir que el agua fluya a través de la columna a una velocidad de aproximadamente 1 mL cada 15 a 20 s.
- Vuelva a llenar la columna con agua según sea necesario hasta que la segunda banda de color haya salido completamente de la columna. Esto suele tardar otros 15 a 25 minutos. A continuación, cierre la llave de paso y cambie el vaso de precipitados de fracción de agua por el vaso de precipitados de residuos.
- Ahora, drena la columna completamente y deja la llave de paso abierta.
- Registre los colores de las fracciones de etanol y agua en su cuaderno de laboratorio.
  Tabla 1: Cromatografía en columna de colorantes alimentarios
  
  Color Volumen (mL)
  Fracción de etanol
  Fracción de agua
  Haga clic aquí para descargar la Tabla 1
- Vierta las fracciones en los cilindros graduados correspondientes de 50 mL y registre el volumen de cada fracción. A continuación, cierre la llave de paso y lleve la columna a una campana extractora.
- Sujete la columna en posición vertical en la campana para que el gel de sílice pueda secarse. Su instructor le dirá cómo limpiar la columna o cómo cuidarla después del laboratorio.
- Ahora, tira por el desagüe las fracciones recogidas y los restos de etanol, agua y solución de tinte y limpia el resto de tu cristalería como de costumbre.
- Desechar las pipetas Pasteur usadas en los residuos de vidrio. Deseche las toallas de papel usadas y el bote de pesaje en la basura del laboratorio y limpie la mesa de trabajo antes de irse.
Resultadosexpandir
En este experimento, se vio que el etanol eluyó la erioglacina azul de manera oportuna, pero no fue un eluyente efectivo para la tartrazina amarilla. La cromatografía en papel del tinte verde muestra resultados similares. Por lo tanto, concluimos que la erioglaucina tiene una menor afinidad por el gel de sílice que la tartrazina.

Ahora, considere las ventajas de usar dos solventes para eluir el tinte por separado. El agua es más polar que el etanol, por lo que suponemos que eluiría ambos tintes más rápido que el etanol solo. Si bien también habría usado menos solvente en general si solo hubiera usado agua, la separación habría sido peor, lo que dificultaría la recolección de fracciones puras.

Alternativamente, podría haber seguido usando etanol después de recolectar la erioglacina, pero habría tomado mucho tiempo y mucho etanol eluir la tartrazina de esa manera. Cambiar el eluyente a agua después de eluir erioglaucina ahorró tiempo y minimizó el desperdicio de solvente sin sacrificar la pureza.