Espectroscopía UV-Vis de colorantes

Fuente: Lara Al Hariri y Ahmed Basabrain en la Universidad de Massachusetts Amherst, MA, EE.UU

1. Comparación de longitudes de onda de absorbanciaexpandir

   En la primera parte del laboratorio, utilizará la espectroscopia de absorción de luz ultravioleta y visible, o la espectroscopia de absorción UV-Vis, para analizar las características de absorción de la fluoresceína, el β-caroteno y el tinte índigo. Para realizar la espectroscopia UV-Vis, colocará una solución entre una fuente de luz y un fotodetector. Las moléculas absorberán la luz en longitudes de onda que correspondan a las energías necesarias para excitar sus electrones y dispersar o transmitir el resto.

   Un espectro de absorción representa la variación en el número de fotones de cada longitud de onda que llegan al detector. Una absorbancia más alta corresponde a menos fotones detectados de esa longitud de onda. Primero tomará un espectro del solvente puro, que el instrumento restará del espectro de la solución de tinte para mostrarle solo los datos de absorbancia del tinte. Esta referencia se denomina blanco solvente.

   • Antes de empezar, ponte una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. nota: Las soluciones de β-caroteno e índigo usan hexano y dimetilformamida, respectivamente, por lo que trabajará con los tintes en una campana extractora. El DMF y el hexano degradarán los guantes finos de nitrilo, así que cámbiate los guantes si te manchan de disolvente.
   • Ahora, obtenga una cubeta de cuarzo limpia. Las cubetas suelen tener dos lados transparentes y dos lados texturizados u opacos. Sujete siempre la cubeta por los lados texturizados para mantener limpios los lados transparentes.
   • Primero, analizará una solución de fluoresceína en agua. Para dejar el solvente en blanco, llene su cubeta aproximadamente 3/4 de su capacidad con agua desionizada.
   • Ahora, limpie los lados transparentes de la cubeta con una toallita de laboratorio. Revise la cubeta en busca de burbujas de aire y golpee suavemente la cubeta para desalojarlas.
   • Luego, lleva la cubeta al espectrómetro. Abra la cámara de muestras del espectrómetro y limpie su cubeta por última vez. Las manchas y el polvo pueden absorber o reflejar la luz, lo que introducirá errores en los datos.
   • Ahora, inserte la cubeta en el portamuestras para que los lados transparentes estén alineados con la fuente de luz. Cierre completamente la puerta de la cámara de muestras. Siga las instrucciones del software de su espectrómetro para configurar un escaneo de absorbancia de 200 a 800 nm y escanee su cubeta como el solvente en blanco.
   • Cuando termine el escaneo, vacíe la cubeta y use aire comprimido para eliminar las gotas grandes de agua.
   • Luego, llévelo a la campana compartida y use una pipeta Pasteur limpia para llenar la cubeta 3/4 de la solución de fluoresceína de 3 μM proporcionada.
   • Revise la cubeta en busca de burbujas de aire y retírelas según sea necesario antes de llevar la cubeta al espectrómetro. Recuerde limpiar los lados transparentes por última vez antes de colocar la cubeta en la cámara de muestras. A continuación, escanee la cubeta como si fuera su muestra.
   • Cuando termine el escaneo, identifique las longitudes de onda que absorbió la fluoresceína. La longitud de onda con la absorbancia más alta se llama λ_max.
   • Registre las longitudes de onda de los picos de absorbancia y el rango de absorción general en su cuaderno de laboratorio y luego guarde los datos.

     Tabla 1: Absorbancia y λ_max de los colorantes

     	Rango de absorbancia (nm)	λmax (nm)
     fluoresceína
     β-caroteno
     añil

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   • Ahora, vacía tu cubeta en los residuos acuosos y enjuágala con agua para eliminar los restos de fluoresceína.
   • A continuación, analizará β-caroteno, por lo que necesita un disolvente de hexano en blanco. Enjuague la cubeta con hexano varias veces para eliminar el agua sobrante antes de llenarla 3/4 de hexano puro.
   • Elimina las burbujas de aire, limpia los lados de la cubeta y colócala en el espectrómetro. Asegúrese de que el escaneo esté configurado para una absorbancia de 200 a 800 nm y, a continuación, escanee la cubeta como un disolvente en blanco.
   • Cuando termine el escaneo, vacíe la cubeta en los residuos orgánicos y séquela con aire comprimido.
   • Utilice una pipeta limpia para llenar la cubeta 3/4 de la solución de β-caroteno de 3 μM proporcionada y vuelva al espectrómetro.
   • Limpia los lados transparentes de la cubeta, colócala en el espectrómetro y escanéala como tu muestra. Escriba las longitudes de onda de los picos en su cuaderno de laboratorio y guarde los datos.
   • Ahora, analiza el tinte índigo. La solución índigo está en DMF, así que vacíe su cubeta en los desechos orgánicos y enjuague el β-caroteno y el hexano sobrantes con DMF puro.
   • Llena la cubeta 3/4 de DMF puro, colócala en el espectrómetro y asegúrate de que los ajustes de escaneo sean los mismos que antes. Ejecute el escaneo de solvente en blanco y luego vacíe la cubeta en los desechos orgánicos y séquela con aire comprimido.
   • Utilice una pipeta limpia para llenar la cubeta 3/4 de su capacidad con la solución de tinte índigo de 3 μM proporcionada y escanéela como su muestra. Anote la información de absorbancia y guarde sus datos.
   • Por último, vacía tu cubeta en la basura orgánica y enjuágala con acetona.
2. β-carotenoexpandir

   En la segunda mitad del laboratorio, utilizará la espectroscopia UV-Vis para relacionar la intensidad y la concentración de la absorbancia del β-caroteno midiendo las absorbancias de 5 soluciones de β-caroteno con diferentes concentraciones. Esto le permitirá hacer una curva de calibración de la absorbancia frente a la concentración de β-caroteno y derivar la ecuación que describe esa relación.

   • Para empezar, haz una tabla en tu cuaderno de laboratorio con columnas para la concentración de β-caroteno y la absorbancia a 450 nm.

     Tabla 2: Absorbancia del β-caroteno

     prueba	Concentración (μM)	Absorbancia a λmáx. (450 nm)
     1	1.9
     2	3.7
     3	7.5
     4	11
     5	15

     Haga clic aquí para descargar la Tabla 2
   • Luego, consigue una cubeta limpia y llénala 3/4 de hexano como tu disolvente en blanco.
   • Elimina las burbujas de aire, limpia los lados transparentes de la cubeta y colócala en el espectrómetro. Configure un escaneo de absorbancia de 200 a 800 nm y escanee la cubeta como la pieza en bruto de solvente.
   • Cuando termine el escaneo, vacíe la cubeta en los residuos orgánicos y séquela con aire comprimido.
   • Luego, use una pipeta limpia para llenar la cubeta 3/4 de su capacidad con la solución de β-caroteno de 1,9 μM, que es la solución de concentración más baja.
   • Limpia los lados de la cubeta, insértala en el espectrómetro y escanéala como una muestra.
   • Cuando finalice el escaneo, muestre la intensidad de absorbancia del pico a 450 nm. Registre esto en su cuaderno de laboratorio como la absorbancia para la solución de 1,9 μM.
   • Ahora, vacíe la cubeta en los residuos orgánicos, enjuáguela con hexano y séquela con aire comprimido.
   • Utilice una pipeta limpia para llenar la cubeta 3/4 de su capacidad con la solución de β-caroteno de 3,7 μM. Limpie los lados de la cubeta, insértela en el espectrómetro y escanéela como otra muestra.
   • Cuando termine el escaneo, anote la absorbancia del pico a 450 nm. Repita esto para las soluciones restantes, trabajando de menor a mayor concentración. Guarde sus datos cuando haya terminado.
   • Por último, vacía la cubeta en la basura orgánica y límpiala con acetona.
3. Resultadosexpandir

   Primero, mira los espectros de los tres tintes. La fluoresceína en el agua absorbe la luz azul y púrpura, con la absorbancia máxima a 490 nm. No absorbe la luz roja y solo absorbe algo de luz amarilla y verde. De acuerdo con esto, la fluoresceína sólida es roja y las soluciones de fluoresceína suelen ser de color amarillo a verde.

   β-caroteno también absorbe la luz azul y morada. La absorbancia máxima del β-caroteno en el hexano es de 450 nm, y verá otro gran pico a 478 nm. La fuerte absorción de la luz púrpura es parte de la razón por la que el β-caroteno aparece de color naranja.

   El índigo en DMF absorbe la luz ultravioleta y la luz roja, naranja y amarilla, con un pico distintivo a 611 nm. Por lo tanto, el tinte índigo refleja principalmente la luz azul y púrpura, lo que le da su color característico.

   • Ahora, haga la curva de calibración para la concentración de β-caroteno. Trace los valores de absorbancia de β-caroteno a 450 nm de la segunda mitad del laboratorio frente a las concentraciones de las soluciones.
   • Luego, aplica una línea de tendencia y encuentra la ecuación lineal que se ajuste a los datos. De acuerdo con la ley de Beer-Lambert, en esta ecuación, y es la absorbancia, x es la concentración y la pendiente es el producto del coeficiente de atenuación molar relevante y la longitud del camino.
   • Revisa tu ecuación. Reorganícelo para resolver la concentración y rellene la absorbancia de β-caroteno a 450 nm de la primera parte del laboratorio. La concentración calculada debe estar cerca de 3 μM/L.