La replicación del ADN se inicia en sitios que contienen secuencias de ADN predefinidas conocidas como orígenes de replicación. El ADN se desenrolla en estos sitios por la helicasa de mantenimiento de minicromosomas (MCM) y otros factores como Cdc45 y el complejo GINS asociado. Las hebras individuales desenrolladas están protegidas por la proteína de replicación A (RPA) hasta que la ADN polimerasa comienza a sintetizar ADN en el extremo 5′ de la hebra en la misma dirección que la horquilla de replicación. Para evitar que la bifurcación de replicación se desmorone, un complejo de protección de bifurcación (FPC) se desplaza con la bifurcación en crecimiento. Este complejo proteico conservado se puede encontrar en los eucariotas y está compuesto por proteínas como Tim, Tipin, And1 y Claspin.

En el laboratorio, las horquillas de replicación pueden detenerse por la acción de la hidroxiurea. La hidroxiurea agota las reservas celulares de dNTP, que son necesarias para la ADN polimerasa para la síntesis de ADN. Cuando los dNTP no están disponibles, la síntesis de ADN se ralentiza y, en última instancia, se detiene por completo. Por lo tanto, el estancamiento de las horquillas de replicación en las células vivas está relacionado con la inactividad de la ADN polimerasa.

La FPC relaciona la actividad de la polimerasa con la de la helicasa. Entonces, incluso cuando la polimerasa se detiene, la helicasa sigue desenrollando el ADN para producir un exceso de ADN monocatenario (ssDNA) antes de detenerse. Este exceso de ssDNA se asemeja a los voladizos resecados de la reparación de roturas de doble cadena. Para estabilizar la estructura, las proteínas RPA se unen al ssDNA y reclutan las proteínas ATR. La unión a ATR activa la proteína reguladora del ciclo celular Chk1 para bloquear la activación de los orígenes de replicación y detener el ciclo celular para la reparación del ADN. Por lo tanto, el ssDNA sirve como una potente señal que conecta el daño del ADN con la reparación.