7.16: Recombinación conservadora específica del sitio y variación de fase

Debido a que los segmentos de ADN se cortan y reorganizan de una manera específica en una dirección, la recombinación específica del sitio ha surgido como una técnica eficiente de ingeniería genética. Las recombinasas de flippasa y ciclación o Flp y Cre, respectivamente, son dos miembros de la familia de recombinasas de tirosina derivadas de bacteriófagos, que se utilizan para mediar inserciones de ADN específicas de sitio, deleciones y expresión dirigida de proteínas en líneas celulares de mamíferos.

Los sitios de reconocimiento para la recombinasa Cre llamados sitios LoxP tienen alrededor de 34 pares de bases de longitud. Los sitios LoxP contienen secuencias palindrómicas de 13 pb, lo que significa que la secuencia de nucleótidos se lee igual en ambas direcciones de 5′ a 3′ y de 3′ a 5′. La recombinación site-specific mediada por recombinasas Cre es uno de los métodos más populares utilizados en la creación de ratones transgénicos con mutaciones adquiridas. El uso de variantes termoestables de Cre recombinasa con promotores específicos de tejidos permite un control espacial sobre la expresión y acción de Cre recombinasa. Por ejemplo, la colocación de un promotor de cadherina específico para el riñón aguas arriba del gen Cre permite que la enzima se exprese solo en los tejidos renales. Para el control temporal de la actividad de la recombinasa Cre, el gen de la enzima se fusiona con un dominio de unión al ligando, de modo que la enzima se expresa solo en presencia del ligando específico.

Una limitación importante en el uso de la recombinación específica del sitio como herramienta de edición del genoma es que el sitio o los sitios objetivo de la recombinación deben insertarse primero o deben estar presentes por casualidad. Si se puede preseleccionar un sitio genómico congruente con el sitio de reconocimiento de la enzima, las recombinasas se pueden usar con una especificidad objetivo “hecha a medida”. Estudios recientes han utilizado la mutagénesis y la mezcla de genes para diseñar variantes de Flp que pueden reconocer funcionalmente sitios con mutaciones combinatorias. Los resultados son prometedores para futuras iteraciones de la mezcla de genes que pueden producir variantes más específicas de Flp y pueden usarse comercialmente como una herramienta molecular para la ingeniería de genomas grandes.