Mancha del Sur

La transferencia de sur es una técnica en la que una sonda de ADN marcada se hibrida con un ADN objetivo para detectar una secuencia particular dentro de un genoma.

La técnica lleva el nombre de Edwin Southern, el biólogo británico que la desarrolló por primera vez.

El procedimiento sigue cinco pasos principales: electroforesis, desnaturalización, transferencia de membrana, hibridación y visualización.

En primer lugar, el ADN genómico es digerido por enzimas de restricción, y los fragmentos de ADN resultantes se cargan en un gel de agarosa y se separan mediante electroforesis en gel.

Para la desnaturalización o separación del ADN bicatenario en dos ADN monocatenario, o ssDNA, el gel se empapa en una solución de hidróxido de sodio.

Luego, el gel se coloca en una esponja en una solución neutralizante de ADN que contiene cloruro de sodio y tampón tris, para restablecer su pH a 7.0.

A continuación, se coloca una membrana de nailon encima del gel y se carga con una pila de toallas de papel. El ssDNA se transfiere a la membrana a través de la acción capilar, mientras que la alta concentración de sal en la solución neutralizante ayuda a que el ADN se una.

Cuando se irradia con rayos UV, el ADN se reticula covalentemente a la membrana. Esto evita la difusión e inmoviliza las bandas de ADN.

A continuación, la membrana se sumerge en una solución de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. La solución recubre la membrana y evita cualquier unión inespecífica con el ADN de la sonda.

Las sondas son ADN corto, monocatenario, que tienen una secuencia complementaria a los fragmentos de ADN objetivo. Para la visualización, las sondas están marcadas con un fósforo radiactivo, P-32, o con una enzima que genera un producto fácilmente detectable.

Cuando la membrana se empapa en una solución tampón que contiene las sondas y se calienta a 42 °C, el ssDNA objetivo se empareja con el ADN de la sonda complementaria para formar un ADN bicatenario, híbrido y marcado.

Después de la hibridación durante la noche, la membrana se lava para eliminar las sondas no unidas.

En el caso del ADN marcado radiactivamente, la membrana se expone a una película de rayos X para su detección.

Las sondas marcadas con enzimas se pueden detectar agregando un sustrato apropiado y visualizando las bandas a medida que se desarrolla el color o la luminiscencia. Debido a que las sondas marcadas solo se unirán a la secuencia de ADN de interés, cualquier banda visible indica la presencia del ADN objetivo.