Secuenciación de Sanger

Para ciertos experimentos o diagnósticos, puede ser necesario obtener la secuencia de nucleótidos de todo el genoma de un organismo para obtener una comprensión más profunda de los genes o alelos presentes, su función y las enfermedades asociadas. Esto se puede lograr mediante la secuenciación del ADN.

Dos técnicas tradicionales de secuenciación de ADN bien conocidas son el método de secuenciación de Sanger y el método de Maxam-Gilbert.

En la secuenciación de Sanger, también conocida como terminación en cadena o secuenciación de didesoxinucleótidos, el ADN molde puro que se va a secuenciar se amplifica por PCR en presencia de cebadores, dNTP y bases modificadas adecuados, llamados didesoxinucleótidos o ddNTP.

Los didesoxinucleótidos carecen del grupo hidroxilo de los desoxinucleótidos, lo que limita su capacidad para formar enlaces fosfodiéster con nucleótidos adyacentes.

Cada didesoxinucleótido también está marcado con una etiqueta fluorescente diferente para facilitar su detección.

El primer paso es desnaturalizar el ADN molde en un ADN monocatenario.

Luego, a medida que los cebadores se unen a la región de interés, la ADN polimerasa comienza a agregar nuevos nucleótidos a la cadena de ADN y, ocasionalmente, incorpora un didesoxinucleótido en lugar de un desoxinucleótido, lo que termina la amplificación del ADN.

El resultado son fragmentos de ADN de diferentes longitudes, cada uno de los cuales termina con un didesoxinucleótido marcado.

A continuación, estos fragmentos de ADN se colocan en un gel capilar para separarlos en función del tamaño, y los espectros de emisión de cada uno de estos fragmentos se analizan mediante un software automatizado para descifrar la secuencia genética del ADN deseado.