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Secuenciación de próxima generación
La secuenciación de próxima generación es el nombre colectivo de un grupo de tecnologías que pueden facilitar la generación relativamente rápida de datos de secuencia de muchas especies diferentes, o de grupos de individuos.
Estos datos se pueden utilizar para genética de poblaciones a gran escala o estudios clínicos, y estas tecnologías son más rápidas y rentables que los métodos de secuenciación tradicionales.
Hay muchos métodos de secuenciación de próxima generación, pero podría decirse que el más popular es la secuenciación de terminación reversible. Otras incluyen la pirosecuenciación y la secuenciación por ligadura.
En la secuenciación de terminadores reversibles, el ADN genómico puro se corta primero en fragmentos más pequeños de 100-1000 pares de bases. A continuación, se ligan adaptadores especiales, que son secuencias de oligonucleótidos con sitios cebadores, a ambos extremos de estos fragmentos de ADN.
A continuación, los fragmentos de ADN monocatenario se cargan en un chip especializado llamado célula de flujo que está prerrecubierto con secuencias cortas de oligonucleótidos complementarias a las secuencias adaptadoras. Los fragmentos de ADN se unen al chip a través de sus adaptadores.
En la etapa de amplificación, la ADN polimerasa se utiliza para sintetizar una cadena de ADN complementaria. El ADN bicatenario se desnaturaliza y la plantilla original se lava.
A continuación, el hebra complementaria restante se dobla y forma una estructura similar a un puente utilizando el segundo adaptador en el otro extremo.
La ADN polimerasa puede sintetizar una hebra complementaria de la hebra de ADN doblada, un proceso llamado amplificación de puente.
El puente bicatenario se desnaturaliza de nuevo para generar ADN lineal monocatenario, que posteriormente puede crear nuevos puentes en el chip.
La ADN polimerasa continúa estos ciclos de amplificaciones puente, sintetizando miles de copias de un fragmento de ADN y dando lugar a la generación de grupos clonales.
A continuación, todas las hebras complementarias inversas se lavan del chip, dejando sólo las hebras de ADN delanteras inmovilizadas en el chip.
La reacción de secuenciación comienza con la adición de ADN polimerasa modificada con dNTP marcados con cuatro etiquetas fluorescentes diferentes. Estos dNTP también contienen una fracción de bloqueo de 3', llamada terminador reversible, que solo permite la adición de un dNTP a la vez.
Después de cada ronda de adición de dNTP a la hebra en crecimiento, se obtienen imágenes del chip y se utiliza la longitud de onda de emisión de cada grupo de ADN para identificar la base.
La secuencia de imágenes de fluorescencia de la celda de flujo capturadas después de cada adición de dNTP se utiliza para determinar la secuencia de los fragmentos de ADN.
El primer proyecto de secuenciación del genoma humano costó 2.700 millones de dólares y se declaró completo en 2003, después de 15 años de cooperación…
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