16.12:

16.12: Hibridación in-situ

In-situ Hybridization

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Molecular Biology

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JoVE Core Molecular Biology

In-situ Hybridization

16.11: Reporter Genes

16.13: Chromatin Immunoprecipitation- ChIP

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02:31 min

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April 07, 2021

Overview

In situ hybridization (ISH) is a technique used to detect and localize specific DNA or RNA molecules in cells, tissue, or tissue sections using a labeled probe. The technique was first used in 1969 for the investigation of nucleic acids. It is currently an essential tool in scientific research and clinical settings, especially for diagnostic purposes.

Types of probes and labels

A probe is a complementary strand of DNA or RNA that binds to corresponding nucleotide sequences in a cell. Many different probes, such as single-stranded DNA probes, double-stranded DNA probes, antisense RNA probes or riboprobes, and synthetic oligodeoxynucleotide probes, are used in in situ hybridization. The choice of probe depends on several factors, including their sensitivity, specificity, stability, and ease of penetration into the tissue sample.

These probes can be labeled with radioisotopes, fluorescent dyes, or other antigen molecules for detection purposes. The ³H, ³⁵S, and ³²P are widely used radiolabeled probes, while non-radioactive labels include biotin, digoxigenin, and fluorescein. These labels can be attached to the probe DNA molecule via end-labeling, nick-translation, or random primer synthesis methods. Detection methods, such as autoradiography, fluorescence microscopy, or immunohistochemistry, are used for target visualization based on the label attached to the hybridized probe.

**Advantages and disadvantages of in situ hybridization**

One of the major advantages of in situ hybridization is that it can even be applied to frozen tissues to enable maximum use of tissues that are difficult to obtain. In addition, it can be combined with other techniques, such as immunohistochemistry, to detect protein and active mRNA in the sample. However, while working with samples that have low DNA and RNA copies, it may be difficult to identify targets using in situ hybridization.

Transcript

La hibridación in situ es una técnica utilizada para localizar ADN o ARN en células cultivadas o en secciones de tejido conservadas químicamente.

La hibridación in situ de ARN se utiliza para controlar dónde se expresa un gen mediante la detección y cuantificación de las transcripciones específicas de ARNm.

Los ARNm diana se detectan mediante sondas de ARN monocatenario complementarias que se crean mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN o se sintetizan mediante una reacción química.

Las sondas están marcadas con isótopos radiactivos, fluoróforos u otras moléculas indicadoras, como biotina o digoxigenina, que pueden unirse y ser detectadas por un anticuerpo marcado.

La hibridación in situ de ARN tiene cuatro pasos principales: fijación de tejidos, permeabilización, hibridación y detección.

Para empezar, se recolecta tejido fresco y se le trata químicamente para detener cualquier reacción bioquímica dentro del tejido y preservar su integridad estructural. Esta técnica de conservación se denomina fijación de tejidos.

A continuación, es necesario eliminar las proteínas y los lípidos del tejido para que la sonda acceda y se una al ARN objetivo.

Para degradar las proteínas y permeabilizar la membrana celular, la muestra se trata con ácido clorhídrico 0,2 molar y enzimas como las proteinasas, mientras que se utilizan detergentes para descomponer los lípidos.

A continuación, el ARN objetivo se hibrida con las sondas a una temperatura justo por debajo del punto de fusión del híbrido ARN-sonda. Esto ayuda a que las sondas se recovan con los ARNm complementarios. Las sondas sueltas y no ligadas se eliminan realizando varios lavados.

El método para detectar las sondas hibridadas depende del tipo de etiqueta. Las sondas radiactivas están expuestas a películas fotográficas, mientras que las sondas fluorescentes son visibles bajo microscopios fluorescentes.

Para otras marcas, los anticuerpos contra la molécula reportera se marcan con un tinte fluorescente o colorimétrico.

La detección de sondas hibridadas revela la distribución de ARNm específicos que indican dónde se expresan los genes de interés.

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