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Perfilado de ribosomas
La elaboración de perfiles de ribosomas o ribosecuenciación es una técnica de secuenciación profunda que produce una instantánea de la traducción acti…
La identificación de regiones en un genoma que se transcriben y traducen en proteínas es un paso vital para comprender un genoma y su expresión.
Esto se logra con una técnica llamada perfil de ribosomas, también conocida como ribo-seq. Mapea las posiciones de los ribosomas en el ARNm e identifica los ARNm que se traducen activamente en proteínas.
Para aislar el ARN, primero se deben lisar las células para acceder a las moléculas que contienen. A continuación, el lisado se trata con RNasas. Estas enzimas escinden los ARNm que no están cubiertos con ribosomas, dejando solo los fragmentos de ARNm protegidos.
A continuación, los fragmentos protegidos por el ribosoma se separan de los fragmentos escindidos no protegidos mediante un gradiente de sacarosa.
A continuación, los ribosomas se eliminan de los fragmentos de ARNm y el ARN se convierte en ADN mediante RT-PCR, utilizando la enzima transcriptasa inversa.
A continuación, se secuencia el ADN y se mapea en el genoma de referencia. Esto determina la ubicación exacta del ribosoma a lo largo de cada ARNm.
El perfil de ribosomas también puede ayudar a identificar marcos de lectura abiertos o ORF no reconocidos. Un ORF es una región del ADN entre un codón de inicio y un codón de parada que se puede traducir en proteína. Encontrar ORFs puede ser útil en la identificación de nuevos genes.
Consideremos el estudio de los patrones de expresión génica en una línea celular de mamíferos. El procedimiento experimental consiste en exponer las células a estímulos que pueden activar la expresión génica e iniciar la síntesis de ARNm.
Los ARNm que se traducen activamente se identifican mediante el perfil de ribosomas.
Este experimento revela que el gen B se está traduciendo mientras que los genes A y C no.
También muestra una pequeña región adicional del genoma, de alrededor de cien nucleótidos de largo, que se está traduciendo activamente.
Esta región no reconocida es un marco de lectura abierto que puede codificar una nueva proteína que está regulada al alza por los estímulos experimentales.
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Q1: What is ribosome profiling and what does it measure?
Ribosome profiling, also called ribo-seq, is a deep sequencing technique that maps ribosome positions on mRNA to identify actively translated genes. It produces a snapshot of the translation landscape in a cell at any given moment by selectively sequencing mRNAs protected by ribosomes, revealing which genes are being translated into proteins.
Q2: How does ribosome profiling isolate and protect mRNA fragments?
Cells are lysed to access internal molecules, then the lysate is treated with RNases that cleave unprotected mRNAs. Ribosomes shield their bound mRNA from cleavage, leaving only ribosome-protected fragments. These protected fragments are then separated from cleaved fragments using a sucrose gradient for further analysis.
Q3: What role do open reading frames play in ribosome profiling analysis?
Ribosome profiling identifies open reading frames (ORFs), which are DNA regions between start and stop codons that can be translated into proteins. Discovering unrecognized ORFs helps identify new genes and novel proteins. In experimental studies, ribosome profiling can reveal previously unknown translated regions upregulated by specific cellular stimuli.
Q4: How is ribosomal RNA contamination addressed in ribosome profiling?
Ribosomal RNA (rRNA) that binds to mRNA is typically removed during ribosome profiling. However, rRNA contaminants sometimes persist. Researchers use the duplex-specific nuclease (DSN) enzyme, isolated from the Kamchatka crab hepatopancreas, which cleaves dsDNA and DNA-RNA hybrids to reduce rRNA contamination in samples.
Q5: What technical challenges does ribosome profiling face?
Ribosome profiling requires large sample amounts, timely translation inhibition, and managing RNA contamination. Flash-freezing efficiently captures ribosome distribution compared to elongation inhibitors like cycloheximide. Data analysis also demands bioinformatics expertise; the riboSeqR R package helps overcome this limitation by providing methods for resolving profiling data across multiple samples.
Q6: How does ribosome profiling convert mRNA to DNA for sequencing?
After ribosomes are removed from protected mRNA fragments, the RNA is converted into DNA using reverse transcriptase through RT-PCR. The resulting DNA is then sequenced and mapped onto a reference genome to determine the exact ribosome location along each mRNA molecule.
Q7: What applications does ribosome profiling have in studying gene expression?
Ribosome profiling enables in vivo monitoring of translation in specific organs or tissues and quantifies new protein synthesis levels. It discovers translated products including short peptides and protein isoforms with unknown functions. The technique also identifies mRNAs that remain untranslated until receiving external signals, revealing dynamic translation regulation.