16.15:

16.15: Perfilado ribosomal

Ribosome Profiling

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Ribosome Profiling

16.14: Synthetic Biology

16.16: Transgenic Plants

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02:24 min

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April 07, 2021

Overview

Ribosome profiling or ribo-sequencing is a deep sequencing technique that produces a snapshot of active translation in a cell. It selectively sequences the mRNAs protected by ribosomes to get an insight into a cell’s translation landscape at any given point in time.

Applications of ribosome profiling

Ribosome profiling has many applications, including in vivo monitoring of translation inside a particular organ or tissue type and quantifying new protein synthesis levels.

The technique helps identify translated open reading frames and discover new translated products, including short peptides and isoforms of characterized proteins with unknown functions. Ribosome profiling also aids in identifying several mRNAs in the cell that are not translated until they receive an external signal.

Technical challenges of Ribosome Profiling

Ribosome profiling faces many technical challenges, such as the requirement for large amounts of samples, dependability on timely inhibiting of translation, and RNA contamination.

The flash-freezing technique can overcome the challenge of rapid translation inhibition. It helps to efficiently capture the ribosome distribution within cells compared to translation elongation inhibitors, such as cycloheximide.

Ribosomal RNA (rRNA) that binds to the mRNA is generally removed during ribosome profiling. However, sometimes a few rRNA contaminants are still observed. Researchers use the duplex-specific nuclease (DSN) enzyme to reduce rRNA contamination, isolated from the hepatopancreas of the Kamchatka crab, that cleaves dsDNA and DNA-RNA hybrids. This method is often also used to normalize cDNA libraries before next-generation sequencing and the exhaustion of rRNA from RNA-seq libraries.

Another limitation of ribosome profiling is in analyzing data, which requires the right expertise in bioinformatics. An R package riboSeqR is used to overcome this issue, which provides methods for resolving ribosomal profiling data for multiple samples.

Transcript

La identificación de regiones en un genoma que se transcriben y traducen en proteínas es un paso vital para comprender un genoma y su expresión.

Esto se logra con una técnica llamada perfil de ribosomas, también conocida como ribo-seq. Mapea las posiciones de los ribosomas en el ARNm e identifica los ARNm que se traducen activamente en proteínas.

Para aislar el ARN, primero se deben lisar las células para acceder a las moléculas que contienen. A continuación, el lisado se trata con RNasas. Estas enzimas escinden los ARNm que no están cubiertos con ribosomas, dejando solo los fragmentos de ARNm protegidos.

A continuación, los fragmentos protegidos por el ribosoma se separan de los fragmentos escindidos no protegidos mediante un gradiente de sacarosa.

A continuación, los ribosomas se eliminan de los fragmentos de ARNm y el ARN se convierte en ADN mediante RT-PCR, utilizando la enzima transcriptasa inversa.

A continuación, se secuencia el ADN y se mapea en el genoma de referencia. Esto determina la ubicación exacta del ribosoma a lo largo de cada ARNm.

El perfil de ribosomas también puede ayudar a identificar marcos de lectura abiertos o ORF no reconocidos. Un ORF es una región del ADN entre un codón de inicio y un codón de parada que se puede traducir en proteína. Encontrar ORFs puede ser útil en la identificación de nuevos genes.

Consideremos el estudio de los patrones de expresión génica en una línea celular de mamíferos. El procedimiento experimental consiste en exponer las células a estímulos que pueden activar la expresión génica e iniciar la síntesis de ARNm.

Los ARNm que se traducen activamente se identifican mediante el perfil de ribosomas.

Este experimento revela que el gen B se está traduciendo mientras que los genes A y C no.

También muestra una pequeña región adicional del genoma, de alrededor de cien nucleótidos de largo, que se está traduciendo activamente.

Esta región no reconocida es un marco de lectura abierto que puede codificar una nueva proteína que está regulada al alza por los estímulos experimentales.

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Perfilado de ribosomas Secuenciación de ribosomas Instantánea de traducción Secuenciación de ARNm Panorama de la traducción Monitorización in vivo Síntesis de nuevas proteínas Marcos de lectura abiertos Péptidos cortos Isoformas Desafíos técnicos Requisitos de muestra Inhibición de la traducción Contaminación por ARN Técnica de congelación instantánea ARN ribosómico (ARNr) Enzima nucleasa específica dúplex (DSN)