Este protocolo es un extracto de Zhao et al, Electrocardiografía de superficie in vivo para pez cebra adulto, J. Vis. Exp.(2019).
Todos los experimentos de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. Todos los protocolos de animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UCLA.
1. Inducción de la anestesia
- Prepare la anestesia de inmersión para el control del dolor y la inmovilización de los peces para evitar artefactos de movimiento durante la adquisición de datos de ECG. La mayoría de los laboratorios utilizan tricaína por inmersión (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato, MS-222).
- Para hacer la solución madre de tricaína al 0,4%, combine los siguientes elementos en una botella de vidrio oscuro con tapa de rosca: 400 mg de tricaína en polvo, 98 ml de agua destilada doble y 2 ml de 1 M de Tris (pH 9). Ajuste a pH 7.0 usando 1 N NaOH o 1 N HCl según sea necesario.
- Para hacer la solución de inmersión final de tricaína, determine la concentración mínima que sea apropiada para la edad, el tamaño, el estado metabólico, la cepa, el modelo de enfermedad, los objetivos científicos y la duración del procedimiento del pez cebra.
- Realizar un estudio de concentración-respuesta de tricaína, aumentando o disminuyendo la concentración recomendada de 168 mg/L (o 0,0168%)9si es necesario, para alcanzar el nivel 4 de anestesia en 3 minutos con la menor cantidad posible de toxicidades cardiorrespiratorias. Por ejemplo, en este estudio, la inmersión de pez cebra AB de tipo salvaje de 12 a 18 meses de edad en una solución de tricaña al 0,02-0,04% inducirá el nivel 4 de anestesia en 3 min.
NOTA: En el nivel 4 de anestesia, el equilibrio y el tono muscular se pierden por completo y la frecuencia de movimiento opercular se reduce.
- Si es necesario, consulte al veterinario en el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) para obtener orientación adicional sobre la idoneidad de la selección de anestésicos y la vía de administración.
- Sumerja un pez cebra adulto en un plato que contenga una solución de tricaína de la concentración más baja predeterminada y aprobada por la IACUC (por ejemplo, 0,02-0,04% en este estudio) para inducir el nivel 4 de anestesia en 3 minutos (Figura 1).
- Para el protocolo de ECG de supervivencia, mantenga la sesión de registro de ECG lo más breve posible (menos de 10 min). Para sesiones breves de registro de ECG que duran menos de 15 minutos, no es necesario el mantenimiento de la anestesia.
- Para sesiones largas de registro de ECG que duren horas, use un paralítico intramuscular de acción prolongada y un sistema de perfusión oral para proporcionar una amplia hidratación y oxigenación.
>2. Colocación de electrodos de ECG
- Una vez que el pez cebra mantenga el nivel 4 de anestesia durante 3 s, use un par de pinzas romas para transferir el pez inmediatamente a la ranura de la esponja húmeda con su superficie ventral hacia arriba para la colocación de electrodos de derivación de ECG (Figura 2).
- Inserte suavemente los tres electrodos de derivación del ECG en la musculatura del pez hasta aproximadamente 1 mm de profundidad para establecer una derivación bipolar en el plano frontal que sea paralela a la orientación craneal caudal-derecha del eje principal cardíaco.
- Coloque el electrodo positivo (rojo) en la línea media ventral a nivel del bulbo arterioso, es decir, a 1-2 mm por encima de una línea imaginaria que conecta los dos bordes inferiores de los opérculos (Figura 2A).
- Coloque el electrodo negativo (negro) caudalmente y 0,5-1,0 mm a la izquierda lateralmente al electrodo positivo, a una distancia mayor que la longitud apicobasal máxima del ventrículo del pez cebra adulto (Figura 2A).
- Coloque el electrodo de referencia (verde) caudalmente, cerca de la región anal.
NOTA: Dado que el eje principal cardíaco varía un poco de un pez a otro, para maximizar las amplitudes de las ondas R y T, ajuste las posiciones de los cables haciendo solo cambios pequeños y sistemáticos a través de prueba y error. Por ejemplo, cambie un electrodo (positivo o negativo), en lugar de ambos electrodos, a la vez y realice cambios graduales en una dirección especificada antes de cambiar a otra dirección en lugar de hacer cambios erráticos en direcciones aleatorias.
3. Registro de ECG
- Abra el programa de adquisición de datos de ECG. Seleccione la configuración deseada en los menús desplegables para rango, paso bajo y paso alto. Por ejemplo, la siguiente configuración en el sistema de registro de ECG in vivo utilizado en este experimento produce una relación señal-ruido consistente y satisfactoria para un pez cebra adulto normal: rango "2 mV", paso bajo "120 Hz" y paso alto "0,03 s".
- Pulse Start para iniciar la grabación continua de ECG sin interrupciones a una frecuencia de muestreo de 1 kHz.
- Para optimizar la posición de los cables para obtener la máxima relación señal-ruido, presione Stop para detener el registro de ECG y revise el rastro de ECG poco después del primer intento de registro para cada corazón. Para diagnosticar que el ECG de un pez cebra adulto es normal, confirme que se cumplen los siguientes cuatro criterios de validación (Figura 3):
- Criterio 1: Asegurarse de que todas las formas de onda del ECG (P, QRS y T) sean distintas y fácilmente visibles.
- Criterio 2: Asegurar que la onda P sea positiva.
- Criterio 3: Asegurarse de que el complejo QRS neto sea positivo (es decir, que la amplitud de la onda R sea mayor que la suma de las amplitudes de las ondas Q y S).
- Criterio 4: Asegurar que la onda T sea positiva.
- Si se espera un ECG normal, vuelva a colocar los electrodos (pruebe primero con el electrodo negativo) si es necesario, hasta que se cumplan los cuatro criterios de validación.
- Si se espera una onda T normal, pero la onda T es demasiado pequeña, vuelva a colocar los electrodos para maximizar la amplitud de la onda T.
- Reanude el registro de ECG después de optimizar el posicionamiento de los cables. Guarde los barridos de ECG para su posterior análisis.
>4. Recuperación de la anestesia
- Al final de la sesión de registro de ECG, retire con cuidado los electrodos sin lastimar a los peces. Transfiera el pescado a agua fresca y oxigenada para peces sin tricaína.
- Para facilitar la recuperación de la anestesia, rocíe agua sobre las branquias vigorosamente con una pipeta Pasteur hasta que el pez reanude el movimiento branquial regular o la natación.
- Monitoree al pez para que se recupere completamente de la anestesia (generalmente 1-2 minutos), según lo indique la capacidad del pez para nadar erguido durante al menos 5 segundos.
