Ensayo de respuesta fotomotora: un método para medir la respuesta conductual de las larvas de pez cebra a un cambio repentino en las condiciones de iluminación

Abstract

Fuente: Steele, W. B., et al. Protocolo experimental para examinar los perfiles de respuesta conductual en larvas de peces: aplicación al neuroestimulante cafeína. J. Vis. Exp.(2018).

Este video describe el ensayo de respuesta fotomotora de larvas de pez cebra y pececillo cabeza gorda utilizando un software de seguimiento automatizado. El protocolo mide la respuesta conductual de las larvas de peces después de un cambio repentino en las condiciones de iluminación.

Protocol

1. Calibración de los parámetros de seguimiento de vídeo

1. Antes de las mediciones de comportamiento, establezca los parámetros de observación y calibración en el software de seguimiento de vídeo (consulte la tabla de materiales).
   1. Coloque una placa de pocillo en la cámara de registro con al menos 1 pez larvario en un pocillo individual. Utilice la placa y el pez asociado como representaciones para establecer los parámetros de calibración.
   2. En el software de pista de video, haga clic en "Archivo | Generar protocolo", que abrirá un cuadro de diálogo del "asistente de creación de protocolos". En el campo "Recuento de ubicaciones", ingrese el número de pocillos individuales de la placa de pocillos y luego haga clic en "Aceptar".
   3. En la parte superior de la pantalla, haga clic en "Ver | Pantalla completa", lo que solicitará al sistema que muestre una vista de la cámara superior de la placa del pozo.
   4. Haga clic en el icono "Dibujar áreas", que aparece como tres formas multicolores. A la derecha del área de visualización de la placa de pocillo, seleccione el icono de círculo en el campo etiquetado como "Áreas".
   5. Utilice el cursor para delinear el área de seguimiento de video circular en el pozo superior izquierdo de la placa de pocillos. Seleccione "Marca superior derecha" y luego delinee el área de visualización del pozo superior derecho. Luego, seleccione "Marca inferior" para delinear el pozo inferior derecho.
      NOTA: Después de dibujar el contorno circular, es probable que sea necesario ajustar su posición. Para ajustar la posición del contorno, haga clic en "seleccionar" y luego use el cursor para mover el área delineada. Además, los contornos se pueden replicar haciendo clic en "Copiar" y luego en "Pegar".
   6. Una vez que se hayan definido las áreas de seguimiento de pozos superior izquierda, superior derecha e inferior derecha, haga clic en "Construir" para solicitar al software que delinee automáticamente las áreas de visualización de los pozos restantes.
   7. En el área etiquetada como "Calibración", haga clic en "Dibujar escala". Utilice el cursor para dibujar una línea horizontal a través de la placa. Una vez que se dibuja la línea, aparecerá un cuadro de diálogo con la etiqueta "Medición de calibración". Ingrese la longitud de la placa del pozo y haga clic en "Aceptar".
   8. Salga del administrador de dibujos haciendo clic en el icono "Dibujar áreas".
   9. Haga clic en el icono "Mosaicos" y, con el cursor, resalte todas las casillas que aparecen en la pantalla de visualización para que cada casilla sea verde.
      NOTA: El icono de mosaicos aparece como un grupo de seis cuadrados pequeños individuales
   10. "Haga clic en Ver| Pantalla completa". A la derecha del área de visualización de la placa, haga clic en "Bkg" en el cuadro "Umbral de detección". Utilice la barra de ajuste de umbral para establecer el umbral de detección de píxeles. Una vez seleccionado el umbral de detección de píxeles adecuado, haga clic en "Aplicar al grupo".
       NOTA: Este protocolo establece el umbral de detección en 13 en modo negro para las observaciones de pez cebra y en 110 en modo transparente para las observaciones de pececillos cabeza gorda.
   11. En el cuadro "Umbral de movimiento", introduzca los parámetros de seguimiento de la velocidad de movimiento deseados. Una vez establecidos los parámetros de velocidad, haga clic en "Aplicar al grupo".
       NOTA: Este protocolo establece movimientos pequeños/grandes a 20 mm/s y movimientos inactivos/pequeños a 5 mm/s. Estas selecciones programan el software para rastrear el movimiento de las larvas de peces a tres niveles de velocidad diferentes: inactivo (congelación) = <5 mm/s, pequeño (crucero) = 5-20 mm/s y grande (estallido) = >20 mm/s.
   12. Haga clic en "Parámetros | Parámetros de protocolo" en el menú desplegable. En el cuadro de diálogo, seleccione la pestaña "Hora". Introduzca el tiempo de observación y el tiempo de integración. Después de ingresar los parámetros, haga clic en "Aceptar".
   13. Para establecer los tiempos de fotoperiodo claro/oscuro y la intensidad de luz para cada fotoperiodo, abra el cuadro de diálogo de configuración del controlador de luz seleccionando "Conducción ligera" en el menú desplegable "Parámetros><". NOTA: Consulte el video del protocolo para configurar varios fotoperiodos claros y oscuros.
   14. Una vez ajustados los parámetros de seguimiento de vídeo, guarde el protocolo de observación.
       NOTA: Este protocolo observa el comportamiento de los peces durante un período de 50 minutos que incluye una fase de aclimatación de 10 minutos seguida de 4 fases de luz/oscuridad alteradas que consisten en dos períodos de luz de 10 minutos y dos períodos de oscuridad de 10 minutos. El tiempo de integración se establece para medir el comportamiento por cada minuto de la prueba de comportamiento de 50 minutos.

2. Observación del comportamiento locomotor y fotomotor de las larvas de peces

1. Coloque la placa de pocillo que contiene los peces experimentales en la cámara de registro de comportamiento.
2. En el software de seguimiento de video, abra el protocolo de seguimiento desarrollado en el siguiente paso.
3. En el visor de seguimiento de vídeo, compruebe que todas las larvas estén visibles en la pantalla del ordenador, que sólo haya una larva individual en cada pocillo y que los pocillos individuales estén alineados dentro de las áreas de observación definidas en los pasos 1.1.5 y 1.1.6.
4. Haga clic en "Experimento | Ejecutar".
   NOTA: El sistema solicitará al usuario que proporcione un nombre y una ubicación para guardar los datos de observación.
5. Una vez que se haya especificado el nombre y la ubicación de almacenamiento de los datos de observación, haga clic en el icono "Varias imágenes en vivo" para resaltar todas las áreas de visualización predefinidas
   NOTA: Este icono se encuentra en la parte superior de la pantalla de la computadora y aparece como un cuadro dividido en cuatro cuadrados más pequeños. Al hacer clic en este icono, se resaltarán todas las áreas de visualización predefinidas.
6. Cierre el panel de la cámara de grabación y haga clic en "Fondo | Inicio" en el monitor de la computadora.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de 48 pocillos	Fisher Científico	08-772-52	Cámaras de registro de comportamiento de larvas de pez cebra
Placas de 24 pocillos	VWR	10062-896	Cámaras de registro de comportamiento de los pececillos de cabeza gorda larvaria