Ensayo de captura de presas: un método para estudiar el comportamiento de captura de presas de la larva de pez cebra

En este artículo

Resumen

Fuente: Muto, A., et al. Ablación de una población neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante imágenes de calcio y registro de comportamiento en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp.(2018)

Este video describe el ensayo de captura de presas. El video discute el método para estudiar el comportamiento de captura de presas de las larvas de pez cebra después de la ablación con láser de neuronas específicas.

Protocolo

1. Evaluación de las consecuencias conductuales después de la ablación con láser

Establezca un sistema de registro de comportamiento que consista en un estereoscopio equipado con una cámara de video. Utilice una cámara con un software de adquisición de imágenes adecuado, comercial o hecho a medida (Figura 1A).
Optimice las condiciones de iluminación para que el paramecio pueda ser detectado por el procesamiento de imágenes. Por ejemplo, use una luz LED blanca anular con un espaciador (Figura 1B).
Nota: La distancia y el ángulo del LED afectan a la apariencia de la muestra (es decir, brillante en un fondo oscuro u oscuro en un fondo brillante) y, por lo tanto, son fundamentales para el procesamiento exitoso de la imagen. Determine la mejor altura del espaciador (Figura 1C).
Coloque una larva de pez cebra (recuperada del experimento de ablación con láser descrito en la Sección 1) en una cámara de registro de comportamiento (que estaba unida a un portaobjetos de vidrio) sin el sello superior original (Figura 1D).
Recoja 50 paramecios suspendidos en agua del vaso de precipitados con una micropipeta y colóquelos en la cámara de registro.
Coloque un cubreobjetos en la parte superior de la cámara de grabación. Ponga una pequeña gota de agua en el cubreobjetos antes de colocarlo en la superficie del agua de la cámara de registro para evitar la introducción de aire en la cámara.
Nota: En este paso, un poco de agua con paramecia se desbordará de la cámara de grabación. El número restante de paramecas en la cámara de registro será de aproximadamente 30-40.
Coloque la cámara de registro (que contiene una larva y paramecios) en el sistema de iluminación (Figura 1D).
Inicie la grabación de lapso de tiempo a 10 fps durante 11 minutos (6.600 fotogramas).
(Opcional) Para cada larva cuyo comportamiento se evaluó, observe la fluorescencia de las áreas ablacionadas con láser mediante microscopía fluorescente para confirmar la efectividad de la ablación con láser (es decir, ausencia o reducción significativa del número de células fluorescentes en el área irradiada con láser)
Nota: Incluso después de la irradiación, todavía se pueden observar algunas células fluorescentes debido al inicio tardío de la expresión del gen Gal4 en las células que se diferenciaron después de la ablación.
Después de registrar el comportamiento de la larva, para compensar la falta de uniformidad en el fondo, realice una división píxel por píxel de cada fotograma por una imagen promedio en Fiji: haga clic en 'Procesar', 'Calculadora de imagen', 'Operación: Dividir', 'Resultado de 32 bits (flotante)' y 'Aceptar'. Para crear una imagen promedio, haga clic en 'Imagen', 'Pilas', 'Proyecto Z', 'Intensidad promedio' y 'Aceptar' (Figura 1E, F).
Cuente el número de paramecas que quedan en la cámara haciendo clic en 'Analizar', 'Analizar partículas', estableciendo un rango de área que cubra todas las parámecas, marcando la casilla de verificación 'Mostrar:Máscaras' y haciendo clic en 'Aceptar'. La opción 'Mostrar:Máscaras' proporcionará una imagen de paramecia extraída (Figura 1G), con una lista del número de partículas (paramecias) en cada fotograma.
Traza el número de paramecas que quedan en la cámara de grabación a lo largo del tiempo. Debido a que las estimaciones del número de paramecas son ruidosas, recomendamos realizar una media móvil en cada punto en un rango de 600 fotogramas (1 min) en la hoja de cálculo.

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Resultados

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Figura 1. Ensayo de captura de presas y datos representativos en larvas de pez cebra ablacionadas con láser.(A) Sistema de registro de comportamiento. El microscopio estereoscópico estaba equipado con una cámara CMOS. Las imágenes se adquirieron utilizando un script hecho a medida. (B) Componentes del sistema de iluminación. Un papel de color gris, un difusor de vidrio, un anillo de luz ...