Ensayo de respuesta de escape: un método para estudiar la respuesta de la larva de pez cebra a los estímulos táctiles

Resumen

Fuente: Sztal, T. E., et al. Uso de ensayos de respuesta y locomoción evocados por el tacto para evaluar el rendimiento y la función muscular en el pez cebra. J. Vis. Exp.(2016)

Este video describe el ensayo de respuesta de evocación al tacto, que mide la respuesta de la larva de pez cebra a los estímulos táctiles.

Protocolo

1. Ensayo de respuesta evocada por el tacto

1. Preparación de 2 embriones dpf para el ensayo de respuesta evocada al tacto
   1. Asegúrese de que la hora del día en que se realiza la prueba sea coherente entre los experimentos><, ya que la actividad puede variar drásticamente a lo largo del día. NOTA: El experimento debe realizarse a ciegas y el orden de las pruebas debe ser aleatorio para minimizar los artefactos experimentales.
   2. Asigne a las cepas de peces un número, que es desconocido para la persona que lleva a cabo el experimento. A continuación, el uso de herramientas en línea disponibles gratuitamente genera una lista aleatoria que dicta el orden de las pruebas.
   3. Al menos una hora antes de la prueba, descoriona los embriones haciendo un agujero en el corion y separándolo suavemente con un par de pinzas finas. Retire cualquier residuo de la placa de Petri antes de volver a la incubadora a 28 °C.
2. Realización de un ensayo de respuesta evocada por el tacto
   1. Calentar la etapa a 28 °C al menos 15 minutos antes de comenzar la prueba.
      NOTA: Esta etapa tiene temperatura controlada y se mantendrá a 28 °C durante la duración de la prueba. La temperatura afectará a la actividad y, por lo tanto, es importante mantener una temperatura constante. Si no se dispone de una etapa calentada, se debe controlar la temperatura del agua y todos los experimentos deben realizarse a la misma temperatura.
   2. Coloque una placa de Petri llena de medio embrionario (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl₂, 0,33 mM de MgSO₄ en agua) sobre una platina iluminada y monte la cámara de alta velocidad sobre la placa de Petri.
   3. Inicie el software de grabación de la cámara de video (como Stream Pix 5, descrito aquí) y en la pestaña "espacio de trabajo" seleccione 1,000 cuadros por segundo (1,000 fps) como velocidad de captura para asegurarse de que se registre la acción de nadar rápidamente de los peces.
   4. Trabajando con un embrión a la vez, coloque el embrión en el centro de la placa de Petri con el pez cebra claramente visible en el campo de visión><. NOTA: Si el embrión se aleja nadando antes del comienzo del experimento, reemplácelo por otro, ya que la recaptura y el posicionamiento del embrión pueden resultar en que se vuelva insensible al estímulo y las respuestas de ráfaga repetidas pueden promover la debilidad muscular en algunos modelos de enfermedades.
   5. Comience a grabar haciendo clic en el botón "grabar" y entregue el estímulo mecanosensorial al embrión tocándolo suavemente con una aguja roma en la parte superior de la cabeza.
   6. Detenga la grabación después de que el embrión haya nadado fuera del campo de visión o haya regresado al reposo.
      NOTA: La aceleración alcanza su punto máximo dentro de los primeros 0,2 segundos de la respuesta de escape de ráfaga después del estímulo mecánico. Por lo tanto, asegúrese de que al menos durante los primeros 0,2 segundos de registro de la respuesta de escape, el pez esté en el campo de visión. Con el software Stream Pix 5, los datos se guardarán automáticamente como un archivo de vídeo .avi. También se pueden utilizar programas de captura de vídeo alternativos, como Free Video Capture o Softonic, que se pueden descargar gratuitamente.
   7. Regrese el embrión a una nueva placa de Petri y seleccione otro embrión para analizarlo. Realizar pruebas en un mínimo de 15 peces.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de Petri de 90 mm	Productos de Laboratorio del Pacífico	PT S90001
Pinzas, estilo 8	ProSciTech	T04-821
incubadora	Termolínea Científica	TEI-43L
Cámara de alta velocidad	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Paso 1.2.3
Unidad de control de temperatura	punto de vista
http://www.randomization.com	N/A		Pasos 1.1.2