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>1. Transferencia de la biblioteca de moléculas pequeñas
Si bien la transferencia de compuestos se puede automatizar con métodos de transferencia robóticos, describiremos el método de transferencia manual.
- Las bibliotecas de moléculas pequeñas se suministran normalmente en un formato de 96 pocillos, y cada compuesto se almacena en DMSO como un stock de 10 mM. Aproximadamente 60 minutos antes de que los embriones alcancen la etapa en la que se van a agregar los compuestos, descongele un número deseado de placas de 96 pocillos que contengan alícuotas de moléculas pequeñas (placa fuente). Tome nota del número de serie u otro número de identificación de las placas de origen. Para minimizar la condensación en las placas, la descongelación puede ocurrir en una cámara de desecación que contiene Drierita (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
- Gire brevemente las placas en una centrífuga de mesa equipada con un adaptador de placa de pocillos múltiples.
- Retire la cinta de sellado de aluminio de la placa de origen. Con una pipeta de 12 canales, diluya los compuestos en la placa fuente hasta la concentración de 0,5 mM (por ejemplo, si comienza con alícuotas de 250 nL de material de 10 mM, agregue 4,75 μL de DMSO a cada pocillo).
- Cuando los embriones en la placa de 96 pocillos (placa receptora) alcancen la etapa deseada, utilice una pipeta de 12 canales (2-20 μL) para transferir 2,5 μL de compuestos (0,5 mM) de las placas fuente a las placas receptoras que contienen los embriones.
- Registre el número de identificación de las placas de origen en las placas del embrión receptor. Cubra las placas receptoras que ahora contienen los embriones y los compuestos con tapas, mezcle suavemente las placas girándolas suavemente y colóquelas en una incubadora a 28,5 ° C.
- Cubra cada placa fuente que contenga moléculas pequeñas no utilizadas (0,5 mM) con una cinta de sellado de aluminio y colóquela en un congelador a -80 °C para un almacenamiento a largo plazo.
>2. Detección de efectos de moléculas pequeñas mediante inspección visual de fenotipos
- Antes de realizar el cribado, formule un criterio específico de lo que constituiría un "golpe".
- En los momentos deseados del desarrollo, retire de la incubadora las placas de 96 pocillos que contienen embriones tratados con compuestos y examine cada pocillo bajo un microscopio estereoscópico. Para una mejor visualización de los cambios sutiles, como los cambios en el patrón circulatorio, se puede utilizar un microscopio invertido con contraste de fase. La microscopía fluorescente se puede utilizar para examinar la perturbación de la expresión de las proteínas GFP o DsRed bajo un promotor específico de tejido.
- Escanee rápidamente las placas de 96 pocillos en busca de cualquier pocillo en el que al menos 3 de 5 embriones exhiban el fenotipo "golpeado" prescrito. Registre la identidad de la placa y la ubicación del pozo de cada posible impacto.
- Vuelva a confirmar un posible acierto volviendo a probar los efectos del compuesto a varias dosis (1 uM, 5 uM, 10 μM y 50 μM). Para cada dosis, se prueban 10 embriones en 0,5 mL de medio E3 en un formato de placa de 48 pocillos. El momento de la adición de compuestos para la repetición de la prueba debe ser idéntico al del cribado original. Un acierto se confirma cuando el fenotipo provocado se reproduce al volver a probar el compuesto
- Identifique el compuesto golpeado de la base de datos de moléculas pequeñas en la biblioteca química.