1. Preparación de embriones/larvas
- Transfiera 100 embriones a una placa de Petri de 100 mm con 25 ml de agua de huevo. No conservar más de 100 embriones por placa de Petri y criarlos a 28 °C.
- Para inhibir la pigmentación, agregue feniltiourea (PTU) en las placas de Petri antes de las 10 horas posteriores a la fertilización (hpf) y críe embriones/larvas hasta 80 hpf. La concentración final de PTU es de 0,2 mM.
PRECAUCIÓN: El PTU es tóxico. Úselo de acuerdo con las pautas de manejo adecuadas.
- Anestesiar las larvas mediante la adición de éster etílico de ácido benzoico de 3 aminoácidos (tricaína), a una concentración final de 0,016%, en las placas de Petri. A continuación, utilizando un microscopio de epifluorescencia, clasifique las larvas positivas para CFP. Use larvas con un tamaño de hígado similar y deseche las que tengan un hígado más pequeño o más grande.
NOTA: cualquier larva CFP positiva, independientemente de su intensidad, puede utilizarse porque no hay diferencia en el grado de ablación de los hepatocitos entre las larvas hemicigotas y homocigóticas.
ATENCIÓN: la tricaína es tóxica. Úselo de acuerdo con las pautas de manejo adecuadas.
- Retire el agua de huevo que contiene tricaína y agregue agua de huevo suplementada con 0,2 mM de PTU. Mantener los embriones/larvas a 28 °C.
2. Tratamiento Mtz
- Prepare una solución fresca de 10 mM Mtz disolviendo 0,171 g de polvo de Mtz en 100 ml de agua de huevo suplementada con 0,2% de DMSO y 0,2 mM de PTU. Para disolver completamente el Mtz, mezcle la solución en RT con agitación rápida durante 20-30 minutos. Para ayudar a solubilizar el Mtz y mejorar la permeabilidad del Mtz en las larvas, agregue DMSO al preparar Mtz.
PRECAUCIÓN: la exposición prolongada o el aumento de la concentración de Mtz son tóxicos. Úselo de acuerdo con las pautas de manejo adecuadas.
- Separe las larvas en grupos de control y experimentales transfiriendo el número deseado de larvas a dos placas de Petri diferentes de 100 mm o placas de pocillos múltiples. Para el grupo experimental, mantener las larvas en una solución de 10 mM Mtz; para el grupo de control, manténgalos en agua de huevo que contenga 0.2% de DMSO.
- Cubra las placas o placas de Petri que contengan la solución de Mtz con papel de aluminio para evitar la fotoinactivación de Mtz e incube a 28 °C. La duración del tratamiento con Mtz depende de la etapa larvaria y de la línea transgénica.
3. Análisis de la regeneración hepática impulsada por la biliar
- Al final del período de ablación, retire la solución de Mtz de las placas. Lave las larvas tratadas con Mtz añadiendo 25 ml de agua de huevo. Agite el plato 2-3 veces para lavar las larvas antes de desechar el agua de huevo. Repita tres veces y luego sumerja las larvas una vez más en agua de huevo. Para evitar el edema cardíaco y la muerte larvaria en las larvas tratadas con Mtz, agregue una concentración más baja de Tricaína, a una concentración final de 0.008%, para inmovilizar las larvas.
- Para el análisis del hígado, examine el tamaño del hígado de las larvas tratadas con Mtz bajo un microscopio de epifluorescencia con el filtro CFP. Evaluar los niveles de ablación de hepatocitos en función del tamaño relativo del hígado: grande (no ablacionado; 0-10% de larvas), mediano (parcialmente ablacionado; 10-20%) y muy pequeño (completamente ablacionado; 80-90%).
