Inyección de morfolino: un método para eliminar la expresión génica objetivo para estudiar la función en el pez cebra

Resumen

Fuente: Hyde D.R., et al. Electroporación in vivo de morfolinos en la aleta de cola de pez cebra adulta en regeneración. J. Vis. Exp. (2012)

El protocolo describe la eliminación dirigida de la expresión génica en el pez cebra mediante la inyección de morfolino en la cola.

Protocolo

1. Inyección de morfolino

1. El día antes de inyectar el morfolino, haga una placa de inyección (Figura 1). Asegúrese de cortar una muesca en un extremo del pozo, lo que ayuda a estabilizar el pescado para el procedimiento de microinyección.
2. Diluir el morfolino marcado con fluoresceína hasta la concentración adecuada (se recomienda comenzar con 1,2 mM) y colocarlo en un baño de agua a 65 °C, durante 5 minutos.
3. Cargue la aguja con el morfolino (nota: dependiendo de si rellena la aguja hacia atrás o hacia adelante, determinará si carga la aguja primero o corta la punta primero).
4. Corta la punta de la aguja en ángulo.
5. Siga las instrucciones de su sistema de microinyección para inyectar una burbuja de aproximadamente 5 nl de morfolino por inyección. Mayores volúmenes de morfolino podrían alterar el tejido.
6. Anestesiar al pez y colocarlo en una placa de inyección. Retire todo el exceso de líquido y oriente la aguja en el lugar adecuado, justo distal al radio óseo (Figura 2). Utilizando un microscopio y un aparato de microinyección apropiados para inyecciones de morfolino (ver Tabla de Reactivos Específicos), inyecte el morfolino en la aleta de anterior a posterior, como se muestra en la Figura 2. La inyección de posterior a anterior hace que el tejido de la aleta se enrolle durante la inyección y es muy difícil.
7. Inserte la aguja suavemente en el tejido regenerativo, justo distal a cada radio óseo (marcado con "1" en la Figura 2) y empuje distalmente hasta ubicarlo en el blastema (marcado con "2" en la Figura 2). Tenga cuidado de no empujar la aguja a través de toda la aleta. Cuando la aguja esté correctamente localizada, inyecte el morfolino (es decir, haga clic una vez). A 1,2 mM, la solución de morfolino marcada con fluoresceína aparece de color amarillo verdoso, incluso en condiciones normales de luz. Con cada inyección, se puede visualizar una "bocanada" amarilla de solución de morfolino, lo que ayuda a localizar la inyección en el blastema. Se deben inyectar aproximadamente 75 nl (10-15 clics) de solución de morfolino por radio óseo. Pausa ~ 1 segundo entre clics. Solo inyectamos la cara dorsal, utilizando la ventral como control solo de electroporación.

Resultados

Figura 1. A. Esquema de la placa de inyección, que está hecha de agarosa y contiene un pequeño pocillo para contener el pez durante la microinyección del morfolino.

Figura 2. Esquema de la microinyección de morfolino. A. Coloque el pescado en el plato con la cabeza del pez en ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Morfolino	GeneTools, LLC		El morfolino debe diseñarse a medida para la proteína de su interés
Bomba de microinyección	Instrumentos de Precisión Mundial, Inc.	PV830	PicoPump neumática Se pueden utilizar muchos sistemas de microinyección diferentes
Micro-manipulador	Instrumentos de Precisión Mundial, Inc.	MMJR	Diestros (MMJL para zurdos)
Agujas de microinyección, 1,0 mm de diámetro exterior	Instrumentos de Precisión Mundial, Inc.	1B100F-4	Estos son capilares de vidrio de borosilicato, tirados en una aguja
Portaagujas	Instrumentos de Precisión Mundial, Inc.	5430-TODOS	Kit de boquillas Pico; asegúrese de insertar la junta de pipeta de 1,0 mm
Tirador de agujas	Instrumento Sutter Co.	P-97	Otros extractores de micropipetas/agujas también deberían funcionar
microscopio	Leica, Nikon, Zeiss	El número varía según el fabricante	Cualquier microscopio estereoscópico con óptica 20X y la capacidad de trabajar con micromanipuladores
2-Fenoxietanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anestesia; diluir 1:1000 en agua del sistema de peces para el procedimiento, 1:500 para la eutanasia