Apareamiento y estadificación de los huevos: un método para generar embriones y clasificarlos por etapa de desarrollo

Abstract

Fuente: Hostelley T.L., et al. Preparación y análisis de muestras de datos de expresión génica basados en RNASeq de pez cebra. J. Vis. Exp. (2017)

El artículo describe un protocolo para generar embriones de pez cebra a través del apareamiento natural y la clasificación de sus etapas de desarrollo. El protocolo se utiliza además para el análisis de células β pancreáticas mediante el uso de peces transgénicos.

Protocol

1. Generación de embriones a través del apareamiento natural

1. Cultivo de embriones hasta los 3 meses de edad, madurez reproductiva.
2. Separe los peces machos y hembras adultos de la cepa deseada en tanques de apareamiento divididos la noche anterior a la recolección de embriones, y agregue 2 machos y 3 hembras a cada tanque><. NOTA: El uso de la cepa reportera fluorescente transgénica insulina2a:mCherry permitió el análisis de células β pancreáticas.
3. Transfiera los peces al tanque de apareamiento con agua dulce del sistema y retire el divisor inmediatamente después de que se enciendan las luces a la mañana siguiente.
4. Permita que los peces se apareen naturalmente hasta que se observen los embriones en el tanque inferior. Recoja los embriones en intervalos de 30 minutos hasta que se recoja la cantidad deseada. Almacene cada punto de tiempo recolectado en placas de Petri separadas en medios embrionarios a 28,5 °C.
5. Realizar la microinyección de material genético o la colocación en medios de cultivo experimentales, si se desea, y cultivar los embriones en medio embrionario de Hank fresco en placas de Petri de 10 cm a 28,5 °C.
   NOTA: Para el análisis de la expresión génica en animales inyectados o mutantes con morfolino (MO), tenga en cuenta que cada manipulación puede tener impactos incidentales en la expresión génica. Los mutantes pueden exhibir una compensación genética a nivel de transcripción que no se observa mediante la segmentación génica basada en MO.

2. Embriones en estadio

1. Cultive los embriones en grupos de 50 a 75 embriones por placa de Petri de 10 cm para promover un tiempo de desarrollo constante de todos los embriones.
2. Monitorear la morfología del desarrollo usando un microscopio de disección en las etapas de blastómero, epibolia y somita para asegurar la progresión del desarrollo.
   NOTA: Retire los embriones moribundos o malformados para evitar retrasos en el desarrollo en la placa.
3. Separe los embriones en función de la edad de desarrollo. Estadificar los embriones y larvas utilizando la longitud corporal total después de 24 hpf.
   NOTA: Los somitas son el tejido mesodérmico en forma de chevrón presente en la parte dorsal del embrión.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCereza	ZIRC	ZL1483
Tanques de acoplamiento Juego de tanques de cruce de 1.0L	Acuareo	ZHCT100
Microscopio de disección	Zeiss