Extracción de ADN de la pinza de la cola: un método utilizado en el genotipado del pez cebra

Resumen

Fuente: Xing L., et al. Genotipado rápido y eficiente de pez cebra mediante PCR con análisis de fusión de alta resolución. J. Vis. Exp. (2014).

Este artículo describe la extracción de ADN de la pinza de la cola del pez cebra. El protocolo demuestra un método rápido y eficiente para analizar los genotipos de pez cebra.

Protocolo

1. Preparación del ADN

1. Prepare el tampón de lisis del ADN: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40. Añadir proteinasa K fresca hasta una concentración final de 1 mg/ml el día de su uso.
2. Recogida de tejidos:
   1. Para clip de aleta de pez adulto:
      1. Anestesiar a los peces: Coloque los peces en una solución de MS-222 (tricaína) al 0,004%. Espere hasta que el movimiento de las branquias disminuya.
      2. Coloque el pescado en una pila de 5-10 toallitas Kimwipes y corte un pequeño trozo de la aleta caudal, de unos 2-3 mm, con una cuchilla de afeitar estéril.
      3. Coloque rápidamente los peces en un tanque etiquetado con agua dulce para su recuperación; etiquete cuidadosamente tanto el tanque como el tubo correspondiente que contendrá el clip de aleta. Cambia el agua y alimenta a los peces cada dos días.
      4. Tome la pinza de aleta con una punta de pipeta estéril y transfiérala a un tubo lleno de tampón de lisis de ADN de 100 μl.
      5. Deseche la punta de la pipeta y deseche la hoja de afeitar en un recipiente para objetos punzocortantes.
   2. Para la pinza de cola del embrión:
      1. Coloque los embriones en una solución de MS-222 (tricaína) al 0,004%. Espere 2 min.
      2. Corta un pedazo de cola con pinzas bajo un microscopio de disección.
      3. Coloque la cola en un tubo marcado lleno de 30 μl de tampón de lisis de ADN.
      4. Coloque rápidamente el embrión en un tubo que contenga 100 μl de paraformaldehído al 4%.
      5. Etiquete los tubos con embriones y sus correspondientes tubos de cola.
      6. Almacene las trompas con embriones a 4 °C durante la noche para su fijación.
      7. Limpie las pinzas con agua Milli-Q y toallitas Kimwipes entre cada embrión para minimizar la contaminación.
   3. Para embriones enteros:
      1. Coloque los embriones en una solución de MS-222 (tricaína) al 0,004%. Espere 2 min.
      2. Coloque de 1 a 5 embriones en un tubo lleno de 100 μl de tampón de lisis de ADN. La decorionación no es necesaria.
3. Digestión de ADN
   Incubar los tubos con tejido (pinzas de aleta o cola o embriones) a 55 °C durante 4 horas hasta toda la noche.
4. Inactivar la proteinasa K
   Calentar los tubos a 95 °C durante 15 min. El ADN debe usarse para PCR inmediatamente o almacenarse a -20 °C durante un máximo de 3 meses.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla maestra LightScanner de 100 reacciones	Biofuego	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricaína
Paraformaldehido