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>1. Preparación de la muestra
- Preparación de la mezcla de agarosa
- 15 min antes de hacer la mezcla de agarosa, derrita una alícuota de 1 ml de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (disuelta en medio E3) en un bloque calefactor ajustado a 70 °C. Una vez que la agarosa esté completamente fundida, transfiera 600 μl a un tubo fresco de 1,5 ml, agregue 250 μl de medio E3, 50 μl de MS-222 al 0,4% y 25 μl de solución de material de perlas en vórtice.
nota: Esto hace 925 μl de la mezcla, mientras que se calculan 75 μl adicionales para el líquido añadido posteriormente junto con los embriones.
- Mantenga el tubo en un segundo bloque calefactor a 38-40 °C o asegúrese de que la agarosa esté muy cerca de su punto de gelificación antes de colocar los embriones de muestra en él.
- Montaje de los embriones
- Tome cinco capilares de vidrio de 20 μl de volumen (con una marca negra, ~1 mm de diámetro interior) e inserte los émbolos de punta de teflón correspondientes en ellos. Empuje el émbolo a través del capilar de modo que la punta de teflón quede en la parte inferior del capilar.
- Transfiera cinco embriones (un número que se pueda montar a la vez) con una pipeta de vidrio o plástico en el tubo de mezcla de agarosa tibia a 37 °C en vórtice.
nota: Trate de llevar un volumen mínimo de líquido junto con los embriones.
- Inserte el capilar en la mezcla y succione un embrión en su interior tirando del émbolo hacia arriba. Asegurarse de que la cabeza del embrión entra en el capilar antes que la cola. Evite las burbujas de aire entre el émbolo y la muestra. Debe haber ±2 cm de agarosa por encima del embrión y ±1 cm por debajo. Repita el procedimiento para los embriones restantes.
- Espere hasta que la agarosa se solidifique por completo, lo que sucede en unos minutos y luego almacene las muestras en medio E3, pegándolas a la pared de un vaso de precipitados con plastilina o cinta adhesiva. La abertura inferior del capilar debe colgar libremente en la solución, permitiendo el intercambio de gases a la muestra.
NOTA: Un protocolo similar a las secciones 1.1 y 1.2 también se puede encontrar en la página wiki de OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.
>2. Posicionamiento de la muestra
- Conjunto de portamuestras
- Inserte 2 fundas de plástico del tamaño correcto (negro) una contra la otra en el vástago del portamuestras. Sus lados cortados tienen que mirar hacia afuera. Fije el tornillo de sujeción sin apretar girándolo 2-3 vueltas. Inserte el capilar a través del tornillo de sujeción y empújelo a través del soporte hasta que la banda de color negro se haga visible en el otro lado. Evite tocar el émbolo.
- Apriete el tornillo de sujeción. Empuje el exceso de 1 cm de agarosa por debajo del embrión fuera del capilar y córtelo. Inserte el vástago en el disco portamuestras.
- Confirme en el software que la platina del microscopio está en la posición de carga. Utilice rieles de guía para deslizar todo el soporte con la muestra verticalmente hacia abajo en el microscopio. Gírelo para que el disco de soporte magnético se bloquee en su posición.