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1. Preparación de embriones
- Después del apareamiento, coseche los embriones en E3 en una placa de Petri e incube a 26,5 °C durante unas 28 h antes de montarlos.
nota: Esto ralentiza el desarrollo de los embriones, de modo que los embriones se encuentran aproximadamente en la etapa de 30 somitas al comienzo de la toma de imágenes.
- Anestesiar embriones en tricaína al 0,016-0,020% en E3. Para inhibir la pigmentación, agregue PTU a una concentración de 200 μM.
- Decorionar los embriones con pinzas bajo un microscopio de disección. Con dos pinzas, agarre y separe suavemente el corion para liberar el embrión.
>2. Montaje en agarosa
NOTA: El método de montaje desarrollado requiere dos concentraciones diferentes de agarosa de bajo punto de fusión en E3 con 0.02% de tricaína y PTU según sea necesario. La primera solución de agarosa contiene una concentración óptima de agarosa en la que la distorsión y la motilidad son mínimas. La optimización se describe en el paso 5 a continuación.
- Calentar las soluciones de agarosa para las dos capas (concentración definida en el paso 5 a continuación y 1%) a 65 °C. Deje que la agarosa se enfríe a aproximadamente 30 °C justo antes de montarla para que el embrión no se vea dañado por el calor. Para el montaje, utilice platos con fondo de vidrio de 35 mm con un fondo de vidrio de cubierta No. 0. El cubreobjetos unido al fondo de la placa crea un pozo poco profundo de 10 mm (aprox. 1,2 mm de profundidad), en el que se colocará el embrión.
nota: En este caso, la concentración con menor motilidad y distorsiones estuvo entre 0,025 a 0,040% de agarosa.
- Coloque suavemente un embrión decorionado con uno de sus lados laterales hacia el fondo de la placa con una pipeta de vidrio o una micropipeta. Si utiliza una micropipeta, corte la parte exterior de la punta para aumentar el tamaño de la abertura y que quepa en el embrión (Figura 1A). Retire con cuidado cualquier resto de E3 con una micropipeta.
- Agregue la primera solución de agarosa al pequeño pocillo creado por el cubreobjetos unido al fondo del plato para cubrir el embrión (Capa 1) (Figura 1B). Asegúrese de que la agarosa cubra el pequeño pozo pero no lo desborde.
- Cubra el pocillo pequeño con un cubreobjetos (22 mm x 22 mm) (Figura 1C) para crear un espacio estrecho lleno de agarosa con el embrión entre los dos cubreobjetos.
- Coloque una capa de solución de agarosa al 1% encima del cubreobjetos por todo el fondo del plato (Capa 2) (Figura 1D). A medida que esta capa se solidifica, mantiene la cubierta de vidrio en su lugar.
- Llene la porción restante del plato con E3 que contiene 0.02% de tricaína para mantener el sistema hidratado (Capa 3) (Figura 1E).
nota: En esta configuración, el cubreobjetos y la agarosa al 1% protegen la capa inferior para que no se diluya.
3. Optimización de la solución de agarosa para la capa 1
- Para identificar la concentración óptima de agarosa para la capa 1, utilice un enfoque de búsqueda de cuadrícula multiescala. Monte los embriones en concentraciones crecientes de agarosa que van desde el 0,01% al 1%, seguidas de imágenes de lapso de tiempo de la restricción del crecimiento embrionario y la motilidad en el campo de visión. Identifique las concentraciones en las que tanto la distorsión como la motilidad son mínimas.
- Para optimizar aún más la concentración de agarosa, monte los embriones utilizando un rango más fino de concentraciones de agarosa (por ejemplo, entre 0,025 y 0,040% de agarosa) dependiendo de la concentración que se considere mejor en el paso 3.1 (por ejemplo, 0,025%, 0,028%, 0,031%, etc.).
nota: En nuestro laboratorio, la concentración óptima de agarosa se situó en torno al 0,03%.
