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1. Configuración del microscopio, adquisición, procesamiento y análisis de imágenes
- Prepare agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión (LMP): Agregue 0,8 g de agarosa LMP a 100 ml E3 y caliente hasta que se disuelva por completo. Mientras está caliente, alícuota 1 ml de agarosa LMP en tubos de microfuga de 1,5 ml en un bloque calefactor a 37 °C. La agarosa LMP permanecerá fundida a 37 °C. Añadir 40 μl de 4 mg/ml (25x), tricanina de pH 7,0 a cada alícuota de 1 ml de agarosa LMP a 37 °C. NOTA: Si trabaja con una cepa pigmentada, añada 20 μl de PTU al 0,15% (50x) a cada alícuota de 1 ml.
- Almacene la agarosa LMP restante durante varios meses en tubos sellados de 50 ml a 4 °C.
- Anestesiar los embriones parabióticos que se van a visualizar añadiendo 1 ml de tricaína de 4 mg/ml (25x), pH 7,0 a los 25 ml de E3 en los que ya se encuentran los embriones.
- Agita suavemente el plato para que los embriones se acumulen en el medio. A continuación, con una pipeta de transferencia de plástico de punta ancha, extraiga los embriones en la menor cantidad de líquido posible. Gire la pipeta en posición vertical y haga rebotar suavemente los embriones para que se asienten en el fondo de la pipeta.
- Con los embriones en el fondo de la pipeta, transfiéralos a una alícuota de 1 ml de agarosa LMP tocando ligeramente la superficie de la agarosa con la punta de la pipeta. Evite transferir el exceso de líquido, ya que esto diluirá la agarosa.
- Después de expulsar el exceso de líquido de la pipeta, utilice la pipeta para mezclar suavemente los embriones dentro de la agarosa, y luego utilice la pipeta para transferir toda la agarosa y los embriones al pocillo de una placa de 6 pocillos con fondo de vidrio (cubreobjetos n.º 1,5).
nota: Asegúrese de desechar la pipeta después de transferir los embriones a la placa de imagen. La agarosa residual se fijará en el interior de la pipeta, lo que la hará ineficaz para su uso posterior. En su lugar, use una pipeta nueva cada vez.
- Debajo de un estereoscopio, use una punta de pipeta con carga de gel fijada en el extremo de una aguja de burla con mango de madera para colocar los embriones hacia el cubreobjetos (para asegurarse de que estén dentro de la distancia de trabajo del objetivo del microscopio) y en la orientación deseada para la obtención de imágenes><.
nota: Vuelva a colocar continuamente hasta que la agarosa se haya cuajado por completo. Tenga cuidado de montar los embriones parabióticos de acuerdo con el embrión de la pareja que se va a obtener la imagen. Dada la orientación aleatoria de los embriones siameses, para algunas parejas puede ser difícil obtener imágenes de ambos embriones. En este escenario, recupere los embriones de la agarosa utilizando fórceps y una pipeta de transferencia de plástico de punta ancha y luego vuelva a montarlos para obtener imágenes desde una perspectiva diferente.
- Una vez que la agarosa se haya endurecido, cubra con 2 - 3 ml de E3 suplementado con tricaína (y PTU si es necesario).
- Tome imágenes de los embriones utilizando un microscopio confocal de epifluorescencia de campo amplio invertido, confocal de escaneo láser o de disco giratorio. Seleccione el objetivo más apropiado para la imagen deseada. Para un campo de visión de todo el embrión, utilice un objetivo 4x. Seleccione un aumento mayor, como un objetivo de 20x, para obtener imágenes de un tejido específico
nota: Si utiliza un microscopio vertical, móntelo en agarosa LMP (similar al anterior) en un cubreobjetos de vidrio. Invierta el cubreobjetos de vidrio en un portaobjetos de microscopio de vidrio que tenga un anillo de grasa para vacío lleno de la misma PTU E3-tricaína.
- Procese las imágenes adquiridas utilizando paquetes de software de análisis de imágenes gratuitos, como NIH Image J/FIJI.
nota: Cuente el número de células y cuantifique la dinámica, como la migración y la división de células, mediante algoritmos de segmentación y seguimiento.