1: Axotomía de dos fotones utilizando un microscopio de dos fotones hecho a medida con un láser Chameleon Ti-Sapphire
- Prepárese para la toma de imágenes. Coloque los embriones montados en un portaobjetos debajo del microscopio. Concéntrese en un embrión con un objetivo de agua de 40X (0,8 NA). Encienda el láser. Hemos sido capaces de visualizar y dañar de forma reproducible las neuronas que expresan GFP utilizando los siguientes parámetros. Para visualizar los axones a una potencia no dañina, ajuste el láser a una longitud de onda de 910 nanómetros (nm) y una potencia de 30 milivatios (los mW enumerados son la cantidad de potencia en la muestra). Abra el software de imágenes. Utilizamos el software ScanImage desarrollado en el laboratorio de Karel Svoboda.
- Presione el enfoque para escanear el embrión con el láser de dos fotones, ubicar el axón que desea axotomizar y capturar una imagen de este axón. Marque la primera y la última posición Z, adquiera la imagen y haga una proyección máxima de las pilas Z.
- Acérquese 70X a la rama del axón que desea axotomizar y deje de escanear. Aumente el mW en la muestra a la potencia dañina de 180 mW y realice un solo escaneo con el láser. Hacemos esto estableciendo el número de cortes Z en 1 y presionando "Agarrar". Esto debería ser suficiente para cortar el axón. Consulte la discusión sobre los métodos para optimizar este procedimiento para su microscopio y objetivo experimental.
- Aléjese, reduzca la potencia a 30 mW y tome una imagen.
2: Axotomía de dos fotones en microscopio confocal/de dos fotones Zeiss 510
- Coloque el embrión montado en el escenario y enfóquelo usando un objetivo de agua 25X u otro objetivo adecuado.
- Encienda los láseres de dos fotones (910 nm) y de argón (488 nm) en una configuración multipista para que sea posible cambiar de uno a otro. Aunque ambos láseres se utilizan para detectar GFP, la emisión de dos fotones se visualiza con rojo y la emisión del láser de argón con verde para diferenciar los dos.
- Utilice el láser de argón para identificar un axón que se va a lesionar. En Configuración Z, marque la primera y la última sección óptica. Tome una imagen confocal y cree una proyección máxima de la pila Z.
- Elija la región del axón que se va a lesionar y foque esta región. Apague el láser de argón y encienda el láser de dos fotones. Escanee el espécimen con los dos fotones a una intensidad láser de transmisión de ~9% para asegurarse de que el axón todavía esté enfocado.
- Haga clic en el botón "detener" para que la herramienta de recorte esté disponible. Utilice el recorte para acercar el área de interés. Por lo general, hacemos zoom a ~ 70X (el zoom se puede verificar en la pestaña "modo"). En la pestaña "canales", cambie la intensidad de los dos fotones de ~9% de transmisión a 15-20% de transmisión.
- Para cortar un axón, active el botón "fast XY" durante aproximadamente 1 segundo y luego presione el botón de parada para evitar daños excesivos. El axón debe verse como un residuo disperso si el procedimiento funcionó.
- Para asegurarse de que el axón se dañó, vuelva al láser de argón de 488 nm, tome otra imagen confocal y cree una proyección máxima.