Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

Resumen

Fuente: Roy, B., et al. Grabaciones de pinzas de parche de células Mauthner embrionarias de pez cebra. J. Vis. Exp. (2013).

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

Protocolo

1. Grabación de pinza de parche (modo de celda completa)

1. Todas las grabaciones se realizan en el modo de fijación de parche de celda completa. Las cámaras de registro se colocan en una platina de microscopio en una configuración de electrofisiología. Nuestras etapas son fijas y el microscopio de pinza de parche vertical está atornillado a una plataforma de microscopio móvil o a un traductor de microscopio.
2. Las pipetas de abrazadera de parche se tiran de un extractor horizontal (P-97; Sutter Instruments Co.) de vidrio de borosilicato de pared delgada obtenido de WPI. Los diámetros de la punta de la pipeta son del orden de 0,2-0,4 μm después del pulido al fuego hasta obtener un borde liso, y el cono del vástago tiene una longitud de ~ 4 mm.
3. Conecte la pipeta a la etapa principal del amplificador en la configuración de electrofisiología. Es importante mantener la platina de la cabeza en un ángulo de aproximadamente 45° con respecto al eje horizontal, ya que esto garantiza un ángulo de entrada para la pipeta adecuado para la formación de sellos de alta resistencia en la célula Mauthner.
4. Justo antes de entrar en la solución de baño, aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para reducir la posibilidad de ensuciar la punta. Al registrar mEPSC, las soluciones de baño incluyen 1 μM de TTX para bloquear los potenciales de acción, 5 μM de estricnina para bloquear los receptores de glicina y 10 μM de bicuculina o 100 μM de picrotoxina para bloquear los receptores GABAA. Al registrar mIPSC, las soluciones de baño incluyen TTX de 1 μM, ácido quinurénico y bicuculina o estricnina, dependiendo de la actividad del receptor de interés.
5. Acérquese a la célula M con una pequeña cantidad de presión positiva en la pipeta. La presión positiva empuja suavemente la célula de un lado a otro y, cuando se coloca inmediatamente sobre la célula, forma un pequeño hoyuelo en la membrana celular. Deje la pipeta en su lugar durante unos segundos para limpiar suavemente la superficie celular y así se pueda formar un sello fuerte entre la pipeta y la membrana. La liberación de la presión positiva en la pipeta permite que se inicie el sellado y una pequeña cantidad de presión negativa junto con potenciales negativos de pipeta da como resultado la formación de sellos de GigaΩ en unos pocos segundos.
6. Cambie el potencial de retención del amplificador a -60 mV. Ruptura de la membrana celular con una serie de pulsos cortos de succión. Registre inmediatamente los potenciales de membrana y minimice los artefactos de capacitancia. Compense la capacitancia de la celda (Cm) y la resistencia de acceso (Ra) (en serie) en un 70-85%. Ra debe ser monitoreado rutinariamente, cada 30 segundos a un minuto, y si hay un cambio del 20% o más, abortar el experimento.
7. Una vez que el experimento ha terminado y se han adquirido suficientes datos, se sacrifica la preparación mediante la extracción del cerebro posterior con un par de pinzas. En este punto, puede comenzar el análisis de datos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extractor de pipetas	Sutter Instruments Co	P-97
Microscopio vertical con pinza de parche	Microsistemas Leica	DMLFSA
amplificador	Dispositivos moleculares	200B
Micromanipulador	Siskiyou Inc.	MX7500