Inyección intramuscular (IM): administración de compuesto en el músculo dorsal de un pez cebra adulto

Resumen

Fuente: Myllymäki, H., et al. Inmunización de peces cebra adultos para el cribado preclínico de vacunas basadas en ADN. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe la técnica de inyección intramuscular para administrar compuestos en los músculos dorsales de un pez cebra adulto.

Protocolo

1. Inyección de la vacuna de ADN y electroporación

1. Para las vacunas de acuerdo con este protocolo, use pez cebra adulto sano de 6 a 12 meses de edad. Mantenga los peces en un sistema de flujo continuo con un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h, con un máximo de siete peces por 1 L de agua.
2. Prepare una solución de éster etílico de ácido 3-aminobenzoico (tricaína) al 0,02% (pH 7) en el agua del tanque para anestesiar a los peces. Usa una placa de Petri de 10 cm o algo similar.
3. Prepare un tanque de recuperación llenando un vaso de precipitados de 5 L con 3 L de agua limpia del sistema.
4. Prepare una almohadilla de vacunación para mantener a los peces en una posición fija durante la vacunación. Tome un trozo de⁵ x 7 cm 2 de una esponja de 2 a 3 cm de grosor. Corta una ranura en la esponja con una hoja de bisturí o unas tijeras afiladas.
   nota: El mismo acolchado de vacunación se puede utilizar en múltiples experimentos. Desinfecte la esponja entre los experimentos remojándola en alcohol etílico al 70% y deje secar.
5. Remoje bien la esponja en el agua del sistema y coloque la esponja en una placa de Petri.
6. Ayunar los peces 24 h antes de las vacunas.
7. Anestesia un pez cebra colocándolo en una placa de Petri que contenga 0,02% de tricaína. Espere hasta que el pez no responda a la estimulación táctil y hasta que no haya movimiento de las branquias. Anestesia a un solo pez a la vez.
8. Con una cuchara de plástico, transfiera el pez cebra anestesiado a la esponja húmeda y coloque el lado ventral del pez hacia abajo en la ranura. En la posición correcta, asegúrese de que la cabeza y la mayor parte del cuerpo del pez estén dentro del surco y que la aleta dorsal y la cola sobresalgan del surco.
9. Bajo el microscopio, coloque cuidadosamente la aguja en un ángulo de aproximadamente 45° cerca del músculo dorsal del pez cebra, utilizando las ruedas de ajuste fino de los ejes x e y del micromanipulador.
10. Encuentra el pequeño punto sin escamas delante de la aleta dorsal, donde empujar la aguja no exige fuerza. Si siente resistencia, pruebe con un lugar adyacente. Evite lesionar la espina, la aleta dorsal o las escamas.
    nota: Si la aguja se dobla al empujar, acorte ligeramente la aguja cortándola.
11. Use el interruptor de pie para inyectar gradualmente la solución de la vacuna en el músculo. Observe la inyección a través del microscopio: el rojo de fenol es visible al entrar en el tejido muscular. Ajuste la duración del pulso si es necesario.
    nota: Alternativamente, use el botón iniciador de pulsos en el panel frontal de la bomba neumática para la inyección. Sin embargo, el uso de un interruptor de pie remoto permite usar la otra mano para ajustar la longitud del pulso mediante la rueda de dial de 10 vueltas. Evite inyectar la solución demasiado rápido, ya que esto puede causar un daño excesivo a los tejidos. Asegúrese de no inyectar aire.
12. Electroporar al pez inmediatamente después de la inyección. Asegúrese de que el pez todavía esté bajo anestesia. Mantenga el pez en la esponja y colóquelo entre los electrodos tipo pinza, de modo que los electrodos estén ubicados a cada lado del sitio de inyección. No presione demasiado las pinzas de los electrodos, pero mantenga ambos electrodos en contacto con el pez.
    1. Presione el botón de inicio en el electroporador para dar seis pulsos de 40 V, 50 ms.
    2. Transfiera suavemente los peces al tanque de recuperación.
    3. Limpie los electrodos después de cada electroporación deslizándolos con etanol al 70%
       nota: Vigile cuidadosamente el bienestar de los peces después de la vacunación. Eutanasiar cualquier pez que muestre signos de malestar (recuperación lenta de la anestesia, natación aberrante, jadeo) en tricaína al 0,04%. Después de la recuperación, transfiera el pez a la unidad de flujo y aliméntelo normalmente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fenol, rojo, sal sódica	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaína (sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato)	sigma	A5040-100g	Solución de anestesia y eutanasia
Pinzas Kits de Electrodos (7 mm)	Aparato BTX Harvard	BTX 450165	Electrodos tipo pinza
Capilares de aluminosilicato	Aparato de Harvard	30-0108
Micromanipulador	Narishige	MA-153
microscopio	Olimpo	ZS61
ECM Electro Cuadrado Porator	Aparato BTX Harvard	BTX ECM 830
Cuchara de plástico
esponja
Banco de trabajo de espuma de poliestireno