Microinyección de embriones: una técnica para introducir un compuesto en la yema del pez cebra

Resumen

Fuente: Sorlien, E. L., et al. Producción e Identificación Eficiente de Knockouts Génicos Generados por CRISPR/Cas9 en el Sistema Modelo Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe una técnica de microinyección de embriones para administrar compuestos en el saco vitelino del pez cebra.

Protocolo

1. Microinyección de componentes CRISPR en embriones de pez cebra

1. Instale los tanques de cría la noche anterior a la inyección colocando el número de machos y hembras deseados (generalmente 2 hembras y 1 o 2 machos) en un tanque de reproducción con un divisor en su lugar.
2. Prepare una placa de microinyección con 1,5% de agarosa en 1x medio E3 (ver Tabla de Materiales) con 0,01% de azul de metileno (un fungicida) vertiendo 35 mL de la agarosa derretida en una placa de Petri de 10 cm y coloque suavemente un molde de plástico para crear canales en forma de cuña en la solución, golpeando el molde para eliminar las burbujas de aire.
3. Deje que la agarosa se asiente y guarde el plato con una pequeña cantidad de medio y envuelto en una película de parafina para evitar que el plato se seque a 4 °C.
   nota: Las placas de inyección son reutilizables durante varias semanas, hasta que los pocillos se deformen o sequen, o hasta que la placa comience a desarrollar moho.
4. En la mañana de la inyección, descongele el sgRNA purificado y la proteína Cas9 en hielo. Recuerde manipular todos los materiales con guantes para evitar la contaminación por RNasa y utilizar puntas y tubos sin RNasa.
5. Genere una solución inyectable de 5 μL combinando la proteína Cas9 y el sgRNA en una proporción de 2:1 de Cas9:sgRNA para obtener concentraciones finales de 400 pg/nL de proteína Cas9 y 200 pg/nL de sgRNA. Incubar la solución Cas9/sgRNA a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que Cas9 y sgRNA formen un complejo de ribonucleoproteínas. Añadir 0,5 μL de solución de rojo de fenol al 2,5% en peso/vol (ver Tabla de Materiales) y agua libre de RNasa hasta un volumen final de 5 μL.
   nota: Se ha demostrado que la fuerza iónica de la solución afecta la solubilidad del complejo Cas9/sgRNA, por lo tanto, la adición de KCl puede aumentar la eficiencia de corte de los sgRNA que exhiben una baja formación de indel.
6. Realice una aguja de inyección tirando de un capilar de vidrio de 1,0 mm con un extractor de micropipetas. Corta la punta de la aguja recién hecha con una hoja de afeitar nueva o pinzas para obtener una abertura en ángulo que perforará fácilmente el corion y el saco vitelino.
7. Coloque la aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector con la fuente de aire encendida. Bajo un microscopio óptico utilizando el aumento adecuado para la calibración determinado para el aparato en particular, ajuste la presión de inyección hasta que la aguja expulse constantemente una solución de 1 nL en una placa de Petri llena de aceite mineral.
   nota: La calidad de la aguja es fundamental. Practique la producción de una aguja e inyecte en el saco vitelino de los embriones hasta que se domine esta habilidad antes de intentar más experimentos.
8. Retire el divisor y deje que los peces se reproduzcan durante aproximadamente 15 min.
   nota: Los tiempos de reproducción más largos producirán más embriones, sin embargo, la inyección debe completarse mientras los embriones están en la etapa de 1 célula para maximizar la posibilidad de que el corte de Cas9 ocurra temprano y, por lo tanto, disminuya el mosaicismo genético. Los embriones pueden inyectarse en etapas posteriores (2-4 etapas celulares), pero esto posiblemente puede disminuir la tasa de transmisión de la línea germinal del alelo modificado.
9. Recoja los huevos con un colador y enjuáguelos en una placa de Petri de 10 cm con 1x medio E3 con azul de metileno al 0,0001%. Examine la salud de los huevos bajo el microscopio óptico, eliminando los huevos no fertilizados y los desechos.
10. Reserve de 10 a 15 embriones como control sin inyectar en una placa de Petri separada y etiquetada.
11. Con una pipeta de transferencia, alinee suavemente los huevos en la placa de inyección calentados a temperatura ambiente.
12. Bajo un microscopio de disección con un aumento de 2,5X, inyecte 1 nL de la solución en el saco vitelino de cada embrión para inyectar un total de 400 pg de proteína Cas9 y 200 pg de sgRNA.
    nota: Para aumentar el corte si lo desea o es necesario, aumente la concentración final de proteína Cas9 a 800 pg/nL y de sgRNA a 400 pg/nL en la solución inyectable; Sin embargo, esto también puede aumentar el esqueje fuera del objetivo y/o disminuir la salud del embrión. La eficiencia de corte también se puede aumentar inyectando directamente en la célula. Sin embargo, la inyección en el saco vitelino es técnicamente menos exigente y proporciona un corte suficiente para producir peces con alta transmisión germinal (>70% de la descendencia que contiene un alelo modificado).
13. Regrese los embriones inyectados a una placa de Petri debidamente etiquetada, cúbralos con 1x medio E3 con azul de metileno y colóquelos en una incubadora de embriones a 28 °C.
14. A las 24 h después de la fertilización (hpf), inspeccionar la salud de los embriones inyectados, eliminando los individuos muertos o con desarrollo anormal y cambiar el medio (Ver Figura 1). Verifique la tasa de supervivencia con respecto al control no inyectado.
    nota: Cuando se dirige a un gen no esencial, se espera menos del 10% de letalidad en relación con el control no inyectado. Si se observan niveles elevados de letalidad en las poblaciones inyectadas por guía en comparación con el control no inyectado, puede indicar que el gen objetivo es esencial para el desarrollo, o que los efectos fuera del objetivo están conduciendo a un desarrollo fallido. Puede ser necesario reducir la cantidad de reactivos CRISPR inyectados o puede ser necesaria la generación de un nuevo sgRNA con efectos reducidos fuera del objetivo.
15. Regrese los embriones a la incubadora y continúe cultivando los embriones a 72 hpf, cambiando los medios diariamente para mantener la salud del embrión.

Resultados

Figura 1: Comparación de la salud de 24 embriones inyectados con hpf. Un embrión vivo (A) desarrollado a 24 hpf, se distingue fácilmente de un embrión que ha abortado el desarrollo (B). Los embriones que se parezcan a (B) o que tengan características drásticamente alteradas a (A), como la curvatura de la columna vertebral o el desarrollo alterado de la cabeza y los ojos, deben retirarse de la placa

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agua libre de RNasa	Cualquier marca		Síntesis de ARNs guía. Termo Tanto Fisher como Qiagen llevan agua adecuada.
Medios de embriones E3	Hecho en casa		Medios para la cría de embriones y Fabricación de placa de inyección. Receta: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140	Se añade a 1x medio E3 para prevenir el crecimiento de hongos en los embriones.
placa de Petri	Termo Fisher	FB0875711Z	Almacenamiento de embriones, placa de inyección de yeso
agarosa	Denville	CA3510-8	Placa de inyección de fundición, geles de agarosa.
Molde de microinección	Herramientas de ciencia adaptativa	AT-1	Crear pocillos para contener los embriones durante la inyección
Rojo de fenol	Sigma-Aldrich	P0290	Tinte para la visualización de la inyección
Aceite mineral	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	Para calibrar el volumen de inyección de la aguja.
Pipetas de transferencia	Cualquier marca		Traslado de embriones
cuchilla	Termo Fisher	11295-10	Aguja de inyección de corte, corte de cola de peces adultos.
incubadora			Mantenimiento de embriones a 28,5 C.
Extractor de pipetas de vértices	David Kopf Instrumentos	700C	Genere agujas para inyección. Instrucciones adicionales para extraer la aguja: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Tubos capilares	Instrumentos Sutter	BF100-58-10	Genere agujas para inyección.
Puntas de microcargador	Eppendorf	930001007	Cargue la solución en las agujas de inyección
Microinyector	Instrumentos de precisión mundial	PV 820	Inyección de embriones.
Microscopio de disección	Leica		Inyección de embriones.
microonda	Cualquier marca		Placa de inyección de fundición, geles de agarosa.
escama	Cualquier marca		Placa de inyección de fundición, geles de agarosa.
Guantes	Cualquier marca		Para todos los aspectos del protocolo.
N2	Cualquier marca		Para expulsar líquido del capilar para la inyección embrionaria
Tubos de tiras de PCR	Cualquier marca		Para todos los aspectos del protocolo.
Puntas de 200 μL	Cualquier marca		Para todos los aspectos del protocolo.
Puntas de 10 μL	Cualquier marca		Para todos los aspectos del protocolo.
Micropipetas	Cualquier marca		Para todos los aspectos del protocolo.