Disección del corazón: un método para observar el desarrollo cardíaco del pez cebra

Resumen

Fuente: Singleman C. et. al., Disección del corazón en pez cebra larvario, juvenil y adulto, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).

Este video describe una técnica para aislar el corazón de un pez cebra en múltiples etapas de desarrollo para estudiar el desarrollo, la maduración y el envejecimiento cardíacos.

Protocolo

1. Medición de peces y disección

1. Coloque un solo pez en una placa de Petri llena hasta la mitad con PBS fresco y colóquelo sobre su lado derecho.
2. Mida la longitud de los peces desde el hocico hasta la base de la cola (el pedúnculo caudal), sin incluir las aletas caudales, utilizando un calibrador digital de mm (Figura 1). Esta es la longitud estándar (SL).
3. A cada pez se le puede asignar una combinación de número / letra para permitir que un pez individual y el corazón diseccionado resultante sean rastreados para su posterior análisis. Los datos, incluido el número de existencias parentales, la edad en el momento de la fijación, las medidas de SL, se introdujeron en una hoja de cálculo y se organizaron en función de estas etiquetas.
4. Antes de la disección, etiquete las tiras de tubo de PCR con el número de seguimiento asignado y llénelas con PBT u otra solución apropiada para un análisis más detallado.
5. Oriente el pez con el lado ventral hacia arriba en una placa de Petri mientras estabiliza el cuerpo con pinzas que sostienen la cabeza entre los ojos y las branquias (Figura 1).

Peces más pequeños (menores de 12mm LE):

6. a) Usando pinzas afiladas, o una microaguja en un soporte de alfileres, retire los músculos pectorales y las aletas del cuerpo para revelar el corazón. El movimiento constante de las pinzas durante la disección puede causar corrientes en el PBT que mueven a los peces. Esto es particularmente problemático para los peces más pequeños, por lo que se puede usar una microaguja para eliminar los músculos pectorales y las aletas y abrir la cavidad corporal.
7. a) Utilice suavemente las pinzas para sacar el corazón de la cavidad desde debajo de la aurícula. Alternativamente, en algunos peces es posible que pueda extirpar el corazón tirando suavemente del bulbo hacia afuera y el resto del corazón seguirá. Tenga cuidado con la ubicación de la aurícula si utiliza esta técnica, ya que puede dañarse fácilmente. Si hay tejido adicional que viene con el corazón, está bien y se puede eliminar después.
8. a) Si el pez contiene un marcador cardíaco fluorescente como Tg(myl7:GFP)^twu34, utilice un endoscopio fluorescente para la disección y verifique la extracción del corazón por fluorescencia (Figura 2).
9. a) Una vez que el corazón se haya extraído de la cavidad, use las pinzas para sostener el corazón y una microaguja para extraer el tejido no cardíaco adicional y el revestimiento epicárdico del exterior del corazón.

Peces más grandes (más de 12mm SL):

b) Utilizando unas microtijeras con mango de resorte, realice tres incisiones de menos de 1 mm de profundidad: 1- corte transversal a través de las branquias 2- corte transversal en la parte anterior del vientre 3- corte sagital en el lado ventral conectando ambos cortes (Figura 3).
1. b) Con pinzas afiladas, retire los músculos pectorales y las aletas del cuerpo para abrir la cavidad corporal y revelar el tejido plateado del pericardio (Figura 4A). Si se extirpa este tejido pericárdico, el corazón se hará visible (Figura 4B).
2. b) Utilizar las microtijeras para cortar la arteria conectada a la arteriosa bulbosa, situada por encima del corazón. Una vez que se corta esta arteria, coloque las puntas de las pinzas debajo de la aurícula, use las pinzas para sacar el corazón de la cavidad. Si hay tejido adicional que viene con el corazón, está bien y se puede extirpar más tarde.
3. b) Una vez que se haya extraído el corazón de la cavidad, use las dos pinzas para sostener el corazón y extraer el tejido adicional, o un par de pinzas para sostener el corazón y una microaguja para extraer el tejido adicional no cardíaco. El revestimiento epicárdico, evidente por su pigmentación negra, se puede eliminar desde el exterior del corazón si se desea raspando suavemente el tejido.

Resultados

Figura 1.Sostenga el pez con pinzas entre los ojos y las branquias.

Figura 2.Un marcador transgénico fluorescente específico del corazón, como Tg(myl7:GFP)^twu34, que se muestra aquí, puede ayudar a visualizar corazones diseccionados de peces más pequeños.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas #55	Herramientas de Bellas Ciencias	11295-51
Microtijeras	Herramientas de Bellas Ciencias	15005-08
Soporte de alfileres	Herramientas de Bellas Ciencias	26016-12
Microagujas	Herramientas de Bellas Ciencias	10130-10
Placas de Petri	BD Biociencias	351029