I denne artikel præsenterer vi en simpel, praktisk teknik for cerebrovaskulære støbning, der er let at udføre og kan udnyttes til billede i vaskulære træet af den voksne musen hjernen.
Vaskulær billeddannelse er af afgørende betydning i den kliniske diagnose og behandling af cerebrovaskulære sygdomme, såsom hjerne arteriovenøse malformationer (BAVMs). Dyremodeller er nødvendige for at studere etiopathology og mulig behandling for cerebrovaskulære sygdomme. Imaging vaskulaturen i store dyr er relativt nemt. Men udvikling af fartøj billeddiagnostiske metoder til murine hjernesygdom modeller er ønskeligt på grund af omkostningerne og tilgængeligheden af genetisk modificerede mus linjer. Imaging den murine cerebrale vaskulære træ er en udfordring. Hos mennesker og større dyr, guldstandarden for at vurdere angioarchitecture på makrovaskulære (konduktans) niveau er x-ray kateter kontrast-baserede angiografi, en metode ikke egnet til små gnavere.
I denne artikel præsenterer vi en metode til cerebrovaskulær støbning, der giver en holdbar skelet af hele vaskulære seng, herunder arterier, vener og kapillærer, der kan analyseres ved hjælp af mange different modaliteter. Komplet støbningen af mikrokar på musen cerebrovasculature kan være svært, men er disse udfordringer op i dette trin-for-trin-protokollen. Gennem intracardial perfusion af det vaskulære casting materiale, er alle skibe af kroppen støbt. Hjernen kan derefter fjernes og tydeliggøres ved hjælp af organisk opløsningsmiddel methyl salicylat. Tredimensionelle billeder af hjernen blodkar kan visualiseres enkelt og billigt med alle konventionelle brightfield mikroskop eller dissektionsmikroskop. Den støbt cerebrovasculature kan også afbildet og kvantificeres ved hjælp af mikro-computertomografi (mikro-CT) 1. Hertil kommer, efter at være blevet afbildet kan de afgivne hjernen være indlejret i paraffin for histologisk analyse.
Fordelen ved denne vaskulære casting metoden i forhold til andre teknikker, er dens brede tilpasning til forskellige analytiske værktøjer, herunder brightfield mikroskopisk analyse, CT-scanning på grund af den røntgenfaste karakteristisketegnende for det materiale, samt histologiske og immunhistokemiske analyse. Dette effektiv brug af væv kan spare dyre forbrug og reducere omkostningerne. Vi har for nylig demonstreret anvendelse af denne metode til at visualisere de uregelmæssige blodkar i en musemodel af voksne BAVM på et mikroskopisk niveau 2, og give yderligere billeder af misdannede skibe afbildes af mikro-CT-scanning. Selv om denne metode har ulemper og er måske ikke ideel til alle typer af analyser, er det en enkel, praktisk teknik, der nemt kan læres og almindeligt anvendt på vaskulær støbning af blodkarrene i hele kroppen.
Vi rapporterer her en metode til støbning af voksne mus cerebrovasculature der kan være afbildet med forskellige modaliteter. Anvendelsen af denne metode for sygdommen modellen BAVM muliggør 3D-analyse af uregelmæssige fartøjer. Potentielle fremtidige undersøgelser omfatter kvantificering af mikro-CT billeder, histologiske analyser af væv, og diagnose af vaskulære sygdomsprogression.
Almindelige problemer og Forslag
Komplet perfusion af hjernen vaskulaturen er ikke altid opnås. Have nok pres for at nå den distale blodkar uden brud i venstre atrium eller aorta er en udfordring. For at overvinde denne, anvende konsekvent presset på ca 100mmHg. Også, justere nålens position til at sikre passende udstrømning af støbning agent i aorta. Det er vigtigt, at carotis arterierne ikke er begrænset, så casting agent kan nå hjernen fartøjer. Kritiske procedurer, der korrelerer med forbedrede lille fartøj prfusion er: (1) korrekt clearing af blod fra kar, (2) filtrering af den støbning agent, og (3) nål placering under støbningen agent injektion. Der bør udvises forsigtighed for at undgå injektion af støbning agent i venstre atrium og lunge. Andre forskere har med succes perfunderet musen 3 og rotter 4 cerebrovasculature uden brug af yderligere procedurer. Manuel analyse af Microfil perfunderet skibe kontrastfarves med hemotoxylin viste 93% fartøj lumen perfusion 5. Altid kassere eller helt ren ethvert værktøj, der kommer i kontakt med støbning agent som det vil polymerisere hurtigt, og værktøjer ikke kan bruges til flere fag. Afklaring af det omgivende musen hjernevæv kan være udfordrende. Efter nedsænkning i methyl salicylat, kan vævet stadig vises uigennemsigtig, hvilket gør fartøj billeddannelse vanskelig. Sikring af korrekt dehydrering og præcisering bør løse dette problem. Placering af hjernevæv på en rocker i løbet af alkohol og methyl salicylate behandling kan forbedre væv afklaring.
Ulemperne ved Teknik
Begrænsningerne af denne teknik kan nævnes: (1) er det nødvendigt at injicere casting agent løsning umiddelbart efter opblanding det, som det vil blive tykkere hurtigt efter katalysatoren er tilsat, (2) udslagsgivende agent fylder stort konduktans skibe nemt, men det gør ikke pålideligt fylde mindre skibe, som f.eks arterioler (modstand fartøjer) og kapillærer (nærende fartøjer), og (3) det er ikke den bedste røntgenfaste kontrast for mikro-CT-scanning, selv om nogle grupper foretrækker Microfil for mikro-CT scanning 1,6. Men efter forslag foreslås ovenfor, herunder korrekt nål placering, skibets position og perfusion pres, kan fuldføre støbning af mindre fartøjer skal opnås. Tilpasningsevne til forskellige analyse værktøjer gør denne agent et værdifuldt redskab til at analysere cerebrovaskulære struktur, herunder arteriel og venøs cirkulation, med forskelligeperspektiver.
Anvendelser af Teknik
Fordelen ved denne metode er dens brede anvendelse potentiale. Den støbte fylder alle fartøjer, herunder arterier, vener og kapillærer af alle væv i kroppen, så vaskulære strukturer i flere organer af forskellige arter kan analyseres. Tidligere har andre grupper brugt denne perfusion til store 7 og lille 8 fartøjer i menneskelige, abe 9, får 10, rotte 4,11,12, og mus 3,13. Vi har nu viser tegn på at bruge denne teknik i at analysere strukturen af mikrokar på mus hjernen hos både raske og syge stater 2. Derudover er der Microfil løsninger med forskellige viskositeter til rådighed for perfuse fartøjer af forskellige størrelser og forskellige farver til at forbedre visualiseringen af fartøjer i forskellige organer. For eksempel kan rød let visualiseres i det blege hjernen parenkym, og gul kontrast godt medmørkerød myokardiet. Desuden, da materialet er røntgenfaste, kan vaskulaturen skal afbildes med mikro-CT-scanning for at få en 3D drejelig billede. Det væv kan også bruges til paraffin sektioner og histologisk analyse efter at være blevet afbildet.
Konklusion
Vi viser her en protokol til at gøre en vaskulær støbt af blodkarrene af den voksne mus hjernen, som kan tilpasses ved hjælp af forskellige analyseteknikker til at studere den morfologiske struktur cerebrovasculature. Vi har også fremlagt beviser for anvendelsen af denne metode til en model af BAVM sygdommen staten, repræsenteret ved forstørret, uregelmæssigt formet fartøjer, shunt blod fra arteriel til venøs cirkulation. Der er en række af vaskulære støbning metoder til rådighed. Den enkle Protokollen giver vi her for en vaskulær støbte kan bruges som et redskab til at undersøge vaskulaturen af den voksne musen hjernen ved hjælp af forskellige billeddiagnostiske metoder.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Voltaire Gungab for at få hjælp med manuskriptet forberedelse. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra: National Institutes of Health (T32 GM008440 til EJ Walker, R01 NS27713 til WL Young, P01 NS44155 til WL Young og H. SU), og R21 NS070153 til H. Su, og den amerikanske Heart Association (AHA 10GRNT3130004 til H. SU).
Name | Company | Catalogue number | Notes |
Microfil | FlowTech, Inc. | MV130 | 4 month shelf life |
Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |