本文介绍一种简单且实用的脑血管铸型技术，操作简便，可用于成年小鼠脑部血管树的成像。
本文内容
摘要
摘要
血管成像在脑血管疾病（如脑动静脉畸形，BAVMs）的临床诊断与治疗中至关重要。研究脑血管疾病的病因病理及潜在疗法需要借助动物模型。在大型动物中进行血管成像相对容易。然而，由于基因修饰小鼠品系在成本和可获得性方面的优势，建立适用于小鼠脑疾病模型的血管成像方法具有重要意义。对小鼠脑部血管系统的成像仍是一项挑战。在人类和较大动物中，评估大血管（传导性血管）水平血管结构的金标准是基于X射线导管对比剂的血管造影术，但该方法并不适用于小型啮齿类动物。
本文介绍一种脑血管铸型方法，可制备出包含动脉、静脉和毛细血管在内的完整血管床的耐用骨架，该骨架可通过多种不同方式进行分析。小鼠脑血管系统微血管的完全铸型可能较为困难；然而，本逐步操作方案中已针对这些挑战提出了解决方法。通过血管铸型材料的心内灌注，可实现全身所有血管的铸型。随后可取出脑组织，并使用有机溶剂水杨酸甲酯进行透明化处理。利用任何常规明场显微镜或解剖显微镜，均可简单且低成本地实现脑血管三维成像。铸型后的脑血管系统还可通过显微计算机断层扫描（micro-CT）1进行成像与定量分析。此外，在完成成像后，铸型的脑组织可包埋于石蜡中，用于组织学分析。
与其它技术相比，这种血管铸型方法的优势在于其可广泛适用于多种分析工具，包括明场显微镜分析、由于材料具有放射不透性而可进行CT扫描，以及组织学和免疫组织化学分析。这种对组织的高效利用可减少动物使用量并降低成本。我们近期已证明该方法可用于在显微水平下可视化成年小鼠脑动静脉畸形（BAVM）模型中的异常血管结构2，并提供了通过显微CT扫描成像的畸形血管的额外图像。尽管该方法存在一些局限性，可能并不适用于所有类型的分析，但它是一种简单且实用的技术，易于掌握，并可广泛应用于全身各部位血管系统的铸型研究。
方案
1. 清除血管中的血液
- 通过腹腔注射将100 mg/kg氯胺酮与10 mg/kg赛拉嗪溶于0.25 ml生理盐水中以麻醉小鼠。
- 确认小鼠对足垫夹捏无反应后，使用剪刀在剑突下方沿胸部横向剪开，切开膈肌，并沿肋骨背侧与腹侧之间向上剪开，以暴露胸腔。将胸骨及邻近胸壁向上翻折，用止血钳固定，暴露心脏。用镊子打开心包膜，暴露心脏。
- 启动连接于37°C水浴中预热的含肝素（5单位/ml）PBS溶液的灌注泵（压力100 mmHg），灌注管末端连接带有钝头22号针头的管路。
- 将针头插入左心室心尖附近，立即剪开右心房以使全身血液流出，持续灌注冲洗直至血液完全从循环中清除。
2. 将铸型剂灌注至血管系统
- 按照制造商的方案制备Microfil（Flow Tech, Inc. Carver, MA）灌注液：将5 ml MV稀释剂与4 ml过滤后的MV化合物混合。加入450μl（5%）催化剂（MV固化剂）。溶液的工作时间为20分钟，但应在使用前立即混合，以确保适当的黏度。
- 用10 ml注射器抽取灌注液，将一根钝头20号针头连接到注射器上，并用溶液填充针头。
- 通过先前用于冲洗血液的同一穿刺孔将针头插入左心室，并用止血钳夹住心脏固定针头位置。
- 以约3 ml/min的速度缓慢将灌注液注入左心室。过高的压力可能导致灌注剂流动异常或血管破裂。
- 观察灌注成功的迹象，包括：在肠和肝脏血管中可见灌注剂、远端肢体变色，以及鼻部和舌头变色。如有必要，调整针头位置以实现充分灌注。
3. 组织的采集与处理
- 取出大脑并置于4°C条件下，用4%多聚甲醛固定过夜。
- 将大脑从多聚甲醛中直接转移至室温下浓度逐渐增加的乙醇中进行脱水：25%乙醇，1天；50%乙醇，1天；75%乙醇，1天；95%乙醇，2天；100%乙醇，2天。
- 将灌注后的大脑浸入水杨酸甲酯中，在室温下处理2天，以清除血管周围脑组织的浑浊。
- 对未经切片且已澄清的完整大脑，可在水杨酸甲酯中将其置于解剖显微镜（图1）（Leica MZFL III显微镜，Leica Microsystems，Bannockburn，IL）或明场显微镜（图2）（Leica DM/LS，Leica Microsystems）下成像。
- 若组织未完全透明，可进行再次澄清处理：将大脑从水杨酸甲酯转移至95%乙醇中2天，再转移至100%乙醇中2天，最后再次转移至水杨酸甲酯中2天。
4. 微型CT成像或组织学应用——组织制备
- 可在透明化处理后或再水化后直接使用显微CT对脑组织进行成像（图4）。
- 为进行组织学分析，需将脑组织通过梯度稀释的乙醇逐步再水化：100% 乙醇，1天；95% 乙醇，1天；75% 乙醇，1天；50% 乙醇，2天；25% 乙醇，2天；最后保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后可按照标准流程将脑组织包埋于石蜡中。
5. 代表性结果
血管铸型后，可在脑表面宏观观察到脑血管系统（图1A）。通过组织透明化处理，可观察到脑实质内部的血管树结构（图1B）。详细的血管结构可在明场显微镜下（图2）、解剖显微镜下（图3）以及微计算机断层扫描（micro-CT）中成像并分析（图4）。利用明场显微镜，无需切片即可在不同焦平面上观察血管系统（图2A），也可在更高放大倍数下观察单个微血管（图2B）。在解剖显微镜下，可在同一焦平面上观察完整的血管结构，从而更清晰地呈现脑血管系统的三维形态（图3）。解剖显微镜下拍摄的图像可展示大血管形态及全脑血管分布，但其细节分辨率不及明场显微镜成像（图2B）。该技术使我们能够在实验性脑动静脉畸形（BAVM）成年小鼠模型中检测到异常血管2。图5展示了通过微CT扫描（图5A）和明场显微镜（图5B）检测到相同异常血管的示例。综上，这些数据表明，在血管铸型后，可利用多种成像工具对同一样本进行分析。
图1. 血管铸型后的小鼠全脑。甲基水杨酸酯溶剂透明化处理前（A）和处理后（B）。血管可在脑表面（A）以及透明化处理后的脑实质内（B）清晰可见。
图 2. 透明化处理后脑组织血管铸型的明场显微镜图像。脑组织可在不同层面和放大倍数下成像。比例尺：200μm（A）和50μm（B）。
图 3. 1倍放大下解剖显微镜图像，显示成年小鼠全脑脑血管系统的背侧观。
图4. 从背侧视角观察图3所示同一只成年小鼠全脑的显微CT扫描图像。
图 5. 应用血管铸型法检测脑动静脉畸形。A）脑血管铸型的显微CT扫描图像，从腹侧视角显示右半球存在扩张、不规则的类似动静脉畸形（AVM）的血管区域。右侧为该区域（白色框内）的放大图像。B）在明场显微镜下以50倍放大倍数观察到的相同不规则血管。比例尺为50 μm。
讨论
本文报道了一种可用于多种成像方式的成年小鼠脑血管灌注铸型方法。将该方法应用于脑动静脉畸形（BAVM）疾病模型，可实现对异常血管的三维分析。未来潜在的研究方向包括微计算机断层扫描（micro-CT）图像的定量分析、组织学分析以及血管疾病进展的诊断。
常见问题及建议
脑血管系统的完全灌注并不总能实现。在不破裂左心房或主动脉的前提下，提供足够压力以到达远端血管是一大挑战。为克服这一问题，应施加约100 mmHg的稳定压力。同时，调整针头位置，确保灌注剂能适当地流入主动脉。必须保证颈动脉未受压迫，以便灌注剂能够到达脑部血管。与改善小血管灌注效果密切相关的关键步骤包括：（1）彻底清除血管系统中的血液；（2）对灌注剂进行过滤；（3）灌注剂注射过程中的针头定位。操作时应特别注意避免将灌注剂注入左心房和肺组织。其他研究者已成功在无需额外操作的情况下完成小鼠3和大鼠4脑血管系统的灌注。对经Microfil灌注并用苏木精复染的血管进行人工分析显示，血管腔灌注率达93%5。任何接触过灌注剂的器械都必须丢弃或彻底清洗，因为该试剂会迅速聚合，且器械不可用于多个样本。小鼠脑组织周围结构的透明化处理可能具有挑战性。即使浸入水杨酸甲酯后，组织仍可能呈现不透明状态，导致血管成像困难。确保充分脱水和透明化处理可解决此问题。在酒精和水杨酸甲酯处理过程中将脑组织置于摇床上，有助于提高组织透明化效果。
该技术的缺点
该技术的局限性包括：（1）混合后必须立即注射铸型剂溶液，因为加入催化剂后溶液会迅速变稠；（2）铸型剂易于填充大口径血管，但无法稳定填充较小的血管，例如小动脉（阻力血管）和毛细血管（营养血管）；（3）它并非微计算机断层扫描（micro-CT）成像中最理想的放射性造影剂，尽管某些研究团队更倾向于使用Microfil进行micro-CT成像1,6。然而，若遵循上述建议，包括正确的针头位置、血管定位和灌注压力，便可实现小血管的完整铸型。该铸型剂适用于多种分析工具，因而成为从多个角度分析脑血管结构（包括动脉和静脉循环）的有力工具。
该技术的应用
该方法的优势在于其广泛的应用潜力。铸型可填充体内所有组织中的全部血管，包括动脉、静脉和毛细血管，因此可分析多种物种多个器官的血管结构。此前，其他研究团队已在人类、猴9、绵羊10、大鼠4,11,12和小鼠3,13的较大7和较小8血管中应用过此类灌注技术。我们目前展示了该技术用于分析小鼠脑内微血管结构的证据，涵盖健康状态和疾病状态2。此外，现有多种不同黏度的Microfil溶液，可用于灌注不同尺寸的血管，同时提供不同颜色以增强各器官内血管的可视化效果。例如，红色在颜色较浅的脑实质中易于观察，而黄色与深红色的心肌组织形成良好对比。更重要的是，由于该材料具有放射不透性，可利用显微CT扫描对血管系统成像，获得可三维旋转的图像。成像后的组织还可用于石蜡切片及组织学分析。
结论
本文展示了一种制备成年小鼠脑血管血管铸型的实验方案，该方案可结合多种分析技术，用于研究脑血管系统的形态结构。我们还提供了证据，表明该方法可用于脑动静脉畸形（BAVM）疾病模型的研究，该模型表现为形态不规则且扩大的血管，导致血液从动脉循环直接分流至静脉循环。目前已有多种血管铸型方法可供选择。本文提供的这一简单方案可作为一种工具，用于通过多种成像方式对成年小鼠脑血管系统进行观察与分析。
披露
实验中使用实验动物的程序已获得加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理和使用委员会的批准。
致谢
作者感谢 Voltaire Gungab 在手稿准备过程中提供的帮助。本工作部分由以下机构资助：美国国立卫生研究院（T32 GM008440 资助 E.J. Walker，R01 NS27713 资助 W.L. Young，P01 NS44155 资助 W.L. Young 和 H. Su，以及 R21 NS070153 资助 H. Su）；美国心脏协会（AHA 10GRNT3130004 资助 H. Su）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Microfil | FlowTech | MV130 | 保质期4个月 |
| 水杨酸甲酯 | 菲舍尔科技 | O3695-500 | 用于组织透明化 |
参考文献
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