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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Crear un modelo de ratón similar al SOP
NOTA: Los ratones utilizados en este estudio eran de fondo mixto (C57/B6, CD1, 129Sv) y se mantuvieron con comida y agua ad libitum en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h a 24 °C.
- Preparación de pellets de DHT
- Tubo de silicona para esterilizar en autoclave. Corte tubos de silicona a una longitud de 15 mm con una cuchilla de afeitar.
- Selle un lado inyectando silicona adhesiva médica en el tubo con una aguja desafilada de 20 G conectada a una jeringa de 3 mL. El émbolo debe retirarse de la jeringa y luego insertarse el adhesivo en el depósito. El émbolo se vuelve a insertar y el adhesivo se empuja hacia abajo hasta que comienza a salir de la aguja. La aguja desafilada se hace cortando el lado de la punta afilada de la aguja de 20 G con unas tijeras fuertes. La longitud de silicona en el tubo debe ser de más de 2 mm para permitir el recorte de posproducción.
- Seque durante la noche; verifique si hay burbujas de aire en el lado sellado. Los que no tienen burbujas de aire se utilizan para gránulos de DHT. Otros se pueden usar para pellets de control sin DHT.
- Use guantes, mascarilla, gafas y bata de laboratorio antes de hacer gránulos de DHT en una capucha para evitar la exposición de DHT a la piel.
- Vierta el polvo de DHT en un recipiente de pesaje de plástico y presione el lado abierto de los tubos tapados con adhesivo (producidos en 1.1.1) en el polvo de DHT.
- El polvo de DHT se puede apisonar con un clip grande que se endereza. Continúe hasta que la DHT alcance una altura de 4 mm (o la longitud deseada). Verifique la longitud de DHT con una regla y selle el lado abierto con silicona, seque durante la noche.
- Corta cada lado sellado para que la longitud de la silicona sea de 2 mm. La longitud total del pellet será de 8 mm.
- Selle ambos lados de la tubería de silástica vacía como pellet de control (sin DHT).
- Mantenga los gránulos en un tubo cónico de 50 ml envuelto con papel de aluminio (para evitar la exposición a la luz) a temperatura ambiente hasta su uso. Los gránulos de DHT mantienen una eficacia total durante al menos 3 meses de almacenamiento.
- Inserción y reemplazo de DHT
- Hasta 20 gránulos de DHT o gránulos de control se sumergen por separado en un tubo cónico de 50 ml con 30 ml de solución salina estéril al 0,9% durante 24 h a 37 °C para el equilibrio justo antes de la inserción.
- Antes de la cirugía, las superficies y los guantes se desinfectan con clidox y las superficies de trabajo se cubren con papel absorbente limpio con respaldo de plástico (almohadilla quirúrgica). Todos los instrumentos que entran en contacto con los animales se descontaminan antes de ingresar a las instalaciones para animales mediante autoclave. Se permitirá que los instrumentos se sequen y enfríen antes de su uso.
- Se utilizan ratones hembra de 2 meses de edad (4-5 ratones/jaula). A los ratones se les inyecta por vía intraperitoneal xilacina (3,5 mg/kg de peso corporal) y ketamina (78,8 mg/kg de peso corporal) utilizando una jeringa de insulina. Los cálculos para mezclar y dosificar la anestesia se encuentran en la Tabla 1.
- Después de lograr la anestesia adecuada, medida por la pérdida del reflejo de los dedos del pie y la respiración lenta, el ratón se preparará para la cirugía.
- Desinfectar la piel de la zona con betadine utilizando gasa estéril y limpiar con etanol al 70%, se volverá a pintar la zona con betadine.
- Corta un agujero de unos 5 mm de largo con unas tijeras debajo de la piel cerca del cuello. Con un trochar de 10 G, haga un pequeño túnel (15 mm) en la dirección rostral. El pellet se inserta dorsalmente con el trochar.
- A continuación, la abertura se sella con adhesivo quirúrgico. Aproxime manualmente los bordes de la herida con pinzas y cepillados suaves para aplicar una película delgada de adhesivo líquido a los bordes de la herida aproximada. Acumule 3 capas delgadas de adhesivo para asegurar que el adhesivo se distribuya uniformemente sobre la herida. El adhesivo debe extenderse 1 cm a cada lado de los bordes de la herida colocados. También se pueden usar clips quirúrgicos o de sutura para cerrar el orificio. Vuelva a colocar a los ratones en una jaula, alojados individualmente, con una almohadilla térmica para su recuperación. Reemplace el pellet cada 4 semanas para mantener un nivel constante de exposición a andrógenos. Se retirará el pellet original y se insertará el nuevo pellet como se describe anteriormente, en una posición similar.
| ketamina
(100 mg/mL)
| Xilacina
(100 mg/mL)
| salino
(0,9%)
|
| 175 μL | 15 μL | 810 μL |
| Inyección intraperitoneal de solución de trabajo: 0,1 mL/20g de peso corporal |
Tabla 1. Cóctel de ketamina/xilacina.