Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Alojamiento básico de ratones
- Aloja a los ratones en jaulas de plástico con fondos y lados sólidos, y una capa de lecho suave y material de anidación, como trituración de papel. Use ropa de cama que esté compuesta de mazorcas de maíz trituradas o virutas de madera, y asegúrese de que la ropa de cama se cambie regularmente para el saneamiento.
- Proporcionar acceso a alimentos y agua ad libitum. La parte superior de la jaula de plástico alberga una tolva de comida. Dispense gránulos de comida para ratones correctamente formulados desde la tolva de alimentos y proporcione un dispensador de agua. Asegúrese de que la parte superior de la jaula tenga un filtro de aire para proteger a los ratones de los contaminantes externos.
- Mantenga los ritmos circadianos naturales de los ratones siguiendo un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas en el alojamiento. Realice pruebas de comportamiento a la misma hora del día, idealmente durante el ciclo de oscuridad del animal, como durante las horas de la noche><.
nota: Se debe tener cuidado para distinguir a los ratones en la carcasa. Existen varios métodos para distinguir a los ratones, como puñetazos en las orejas, marcas en las orejas y marcas en la cola.
>2. Pruebas del laberinto de Barnes: Construcción
- Consigue una tabla circular de madera de 120 cm de diámetro.
- Corta 20 agujeros circulares (4,5 cm de diámetro) alrededor del perímetro del círculo. Coloque cada agujero a 2,5 cm del borde del laberinto y a 13 cm de los agujeros vecinos.
- Alisa las superficies y píntalas de blanco brillante (se recomienda un color brillante).
- Designe un lado de la tabla del laberinto para la inserción de pequeños ganchos para tazas a unos 2-3 cm de distancia de cada uno de los 20 agujeros y coloque dos ganchos para cada agujero (uno a cada lado de cada agujero).
- Use discos negros (de plástico) poco profundos para cubrir los agujeros en los lados del laberinto con ganchos. Use ganchos para asegurar bandas elásticas gruesas para sujetar los discos en el fondo del laberinto.
- Monta el laberinto Barnes de forma segura a 120 cm del suelo y lejos de otros objetos de altura similar, como mesas o sillas. Se puede usar una caja o taburete para apoyar el centro del laberinto.
- Coloque carteles blancos grandes con una forma en cada pared (triángulo, círculo y cruz) como pistas adicionales del laberinto en 3 lados del laberinto. Mantenga los carteles en las paredes alrededor del laberinto para cada prueba.
- En el último lado del laberinto, coloque una cortina negra sólida para ocultar a los observadores, de modo que los datos puedan registrarse con precisión sin que los investigadores sean visibles para los ratones en el laberinto.
- Suspende una cámara de video sobre la arena con una vista panorámica de toda la superficie del laberinto.
- Limpie todas las superficies del laberinto (discos negros y caja de objetivos incluidos) con agua y luego con una solución de etanol al 70% antes y después de cada prueba con el ratón.
- Coloque una fuente de luz de 100 W a 25 cm sobre el centro del laberinto (encienda / apague al comienzo / final de la prueba) y asegúrese de tener los discos y ganchos hacia el suelo.
nota: Todas las demás luces de techo de la habitación deben apagarse durante la prueba. Se recomienda la adición de un generador de ruido ultrasónico colgado junto a una luz de 100 W. Actívalo o desactívalo al inicio/final de cada prueba.
>3. Prueba del Laberinto de Barnes: Procedimiento
NOTA: Asegúrese de que todos los componentes del laberinto se limpien con agua y solución de etanol al 70% antes y después de cada prueba, dejando tiempo para que se seque completamente antes de reanudar la prueba. Asegúrese de tener listos los suministros de limpieza, así como los temporizadores para las pruebas.
- Aloja a todos los ratones en grupos utilizando un método de identificación fiable. Mantenga a los ratones fuera de la sala de pruebas cuando no estén corriendo activamente en el laberinto. Esto es para garantizar que no se sometan al generador de ruido ultrasónico prematuramente.
- Manipule a los ratones levantándolos suavemente y sosteniéndolos desde la base de la cola, con las patas en la mano.
- Para el entrenamiento, haga que los ratones corran por el laberinto diariamente una vez al día durante 7 días seguidos para evaluar el aprendizaje>nota: Se puede realizar una sola prueba a largo plazo en una fecha posterior para evaluar la memoria o la retención. El protocolo actual entrenó ratones adolescentes a partir del día 32 postnatal y se realizó un ensayo a largo plazo en adultos a los 4 meses de edad.
- Asigne aleatoriamente cada mouse a un orificio objetivo para usar durante el período de prueba. Los agujeros se pueden etiquetar del 1 al 20 en la parte inferior del laberinto o en el exterior del perímetro del laberinto, donde no son visibles para el ratón en el laberinto.
- Reemplace el disco de orificio asignado por una pequeña caja negra (23 x 11 cm). Sujételo firmemente al laberinto de Barnes con bandas elásticas conectadas a los ganchos más cercanos.
nota: La caja de destino es lo suficientemente poco profunda como para que el ratón pueda entrar fácilmente en ella o contiene un escalón para garantizar que el ratón no tenga que saltar en ella.
- Coloque el ratón en el centro del laberinto debajo de una taza para aclimatarse durante 30 segundos hasta que comience la prueba. Comienza la grabación de video.
- Encienda el generador de ruido ligero y ultrasónico. Levante la copa a través de un mecanismo de cuerda para evitar sesgar el rumbo inicial del animal. Pon un temporizador y siéntate detrás de la cortina para observar.
- Después de que el mouse ingrese al orificio objetivo, cubra el orificio con la misma taza opaca que se usó al comienzo de la prueba o con un aglutinante y apague el generador de ruido ultrasónico. Si el ratón no ha entrado en el objetivo después de que hayan transcurrido 5 minutos, acorrale al ratón en el agujero objetivo.
- Asegúrese de que el mouse entre en el agujero. Cuando el mouse esté dentro de la caja de destino, cubra el orificio y apague el generador de ruido. Deje que el ratón permanezca en la caja de destino durante 1 minuto sin ser molestado.
- Aunque el agujero objetivo permanecerá constante para cada ratón durante todo el período de entrenamiento, ejecute ratones en un orden aleatorio cada día para asegurarse de que no estén siguiendo ninguna señal/olor dejado por el ratón anterior.
