Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inducción SE
- Compre ratones machos C57BL/6NHsd de 8 semanas de edad y pese cada ratón. Luego, use un rotulador para marcar las colas de todos los ratones para su fácil identificación durante la inducción de SE.
- Calcule la cantidad de bromuro de metilo de escopolamina (escopolamina; 2 mg/kg), hemisulfato de terbutalina (terbutalina; 2 mg/kg) y clorhidrato de pilocarpina (pilocarpina; 280 mg/kg) en función del peso del ratón y agregue solución salina (NaCl al 0,9%, 10 mL/kg) para hacer las soluciones
NOTA: Por ejemplo, si el peso del ratón es de 25 g, se aplican las siguientes cantidades: Escopolamina y terbutalina: 2 mg/kg* (25 g/1.000 g) = 0,05 mg, Suero fisiológico: 10 mL/kg* (25 g/1.000 g) = 0,25 mL, Pilocarpina: 280 mg/kg* (25 g/1.000 g) = 7 mg, Suero fisiológico: 10 mL/kg* (25 g/1.000 g) = 0,25 mL.
- Cargue la mezcla de escopolamina y terbutalina en una jeringa de 1 ml con una aguja de 30 G. Inyecte la solución por vía intraperitoneal en cada ratón y luego devuelva los ratones a sus jaulas. A los 30 minutos después de la administración de escopolamina y terbutalina, inyecte la solución de pilocarpina en cada ratón (i.p.; jeringa de 1 mL; aguja de 30 G). Inmediatamente después de la inyección de pilocarpina, coloque a los ratones en una incubadora (28-30 °C) para su observación.
- Monitoree cuidadosamente el comportamiento de los ratones hasta que se induzca la SE. Si se detectan convulsiones motoras límbicas que corresponden a la etapa 3 o superior según la escala de Racine, registre el tiempo y monitoree a los ratones para determinar si las convulsiones ocurren con más frecuencia. Una vez que las convulsiones motoras continuas duren más de 2 minutos, coloque al ratón en una nueva jaula a temperatura ambiente y manténgalo monitoreando durante 3 h para determinar si sus convulsiones continúan y se induce la EE. Eutanasiar a los ratones que no lograron entrar en SE aproximadamente 2 h después de la inyección de pilocarpina.
NOTA: Escala de Racine; etapa 1, movimiento bucal y facial; Etapa 2, asentir con la cabeza; estadio 3, clonus de las extremidades anteriores; etapa 4, cría con clonus de extremidades anteriores; Etapa 5, crianza y caída con clonus de extremidades anteriores. Si el ratón no se transfiere a la jaula a temperatura ambiente inmediatamente después de la inducción de SE, el ratón puede morir debido a la hipertermia.
- Terminar las convulsiones agudas conductuales a las 3 h después del inicio de la EE inyectando solución de diazepam (i.p.; 10 mg/kg; jeringa de 1 mL; aguja de 30 G). Prepare la solución de diazepam diluyendo 5 mg/mL de diazepam en aceite de ricino hidrogenado polioxilo 35 al 10% mediante la adición de solución salina (i.p.; 10 mL/kg; jeringa de 1 mL; aguja de 30 G).
NOTA: Solución de aceite de ricino hidrogenado polioxil 35 al 10%: 1 ml de solución de aceite de ricino hidrogenado polioxil 35 + 9 ml de solución salina. Guarde la solución a temperatura ambiente. Por ejemplo, si el peso corporal del ratón es de 25 g, inyecte 250 μL de solución de diazepam: 50 μL 5 mg/mL de diazepam + 200 μL de solución de aceite de ricino hidrogenado polioxilo 35 al 10% = 250 μL 1 mg/mL de diazepam.
- En el caso de ratones simulados, se debe inyectar la mezcla de bromuro de metilo y hemisulfato de escopolamina y terbutalina (i.p.; ambos 2 mg/kg, 10 mL/kg; jeringa de 1 mL; aguja de 30 G). 30 min después, inyectar la solución salina por vía intraperitoneal (i.p.; 10 mL/kg; jeringa de 1 mL; aguja de 30 G)
NOTA: Si el peso corporal del ratón es de 25 g, inyecte 250 μL de solución salina en lugar de pilocarpina.
- Después de la inyección de diazepam (i.p.; jeringa de 1 mL; aguja de 30 G), administrar 1 mL de dextrosa al 5% por ratón individual (i.p.; jeringa de 1 mL; aguja de 26 G)
NOTA: 1 mL de inyección de dextrosa al 5% proporciona una fuente de energía e hidratación que puede aumentar la tasa de supervivencia.
- Durante el cuidado posterior en la incubadora (28-30 °C), limpie las secreciones excesivas como saliva, lágrimas y heces.
- En el día 1 después de la inducción de SE, pesar a los ratones y mantenerlos en la incubadora (28-30 °C) durante un día más. En el día 2, después de la inducción de SE, pesa a los ratones y devuélvelos a su jaula de origen. Proporcione comida húmeda para facilitar su recuperación.
NOTA: En este experimento, la tasa de mortalidad por C57BL/6NHsd después de la terminación de la SE fue del 8,57% en promedio (3 de 35 ratones probados).
- Medir el peso corporal diario de los animales hasta 7 días después de la pilocarpina e inyectar a los ratones dextrosa al 5% (i.p.; jeringa de 1 mL; aguja de 26 G) cuando el peso corporal no haya aumentado. Detenga el control del peso corporal cuando los ratones comiencen a recuperar el peso corporal y consuma comida húmeda sin dificultad a los 2 días después de la inyección de pilocarpina.
NOTA: Si el peso corporal de un ratón no aumentó hasta 7 días después de la EE, excluya al ratón del experimento y eutanasiarlo con dióxido de carbono. Dependiendo del fondo del ratón, ocasionalmente puede ocurrir la muerte; sin embargo, en el caso de C57BL/6NHsd, menos del 1% de los ratones murieron en estos experimentos. Con una supervivencia de más de 7 días después de la inducción de SE, los ratones rara vez mueren durante el período de latencia.
