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1. Preparación de sondas de nanopartículas
NOTA: Este ensayo utiliza nanovarillas de oro funcionalizadas (AuNRs; 25 nm de diámetro x 71 nm de longitud) que se conjugan covalentemente con polímeros de neutravidina (AV) y tienen un pico de resonancia de plasmón superficial que produce una señal de dispersión roja (641 nm pico) tras la iluminación DFM.
- Lavar 40 μL de AuNR-AV (2,56 x 1011 partículas) tres veces con 200 μL de PBS (pH 7,0) por centrifugación y aspiración (8.500 x g a 4 °C durante 10 minutos), seguido de una etapa final de centrifugación y aspiración, después de la cual el pellet de AuNR-AV se suspende en 40 μL de PBS.
- Mezclar esta suspensión de AuNR-AV con 10 μL de anticuerpo biotinilado (0,5 mg/mL) específico para un antígeno en la superficie del subtipo de exosoma de interés y 150 μL de PBS y luego mezclar a 4 °C durante 2 h usando un mezclador para permitir que la unión de neutravidina-biotina llegue a completarse.
- Lavar las AuNRs conjugadas con anticuerpos resultantes (AuNR-IgG) tres veces por centrifugación y aspiración (6.500 x g a 4 °C durante 10 minutos) y luego suspenderlas en 200 μL PBS y almacenarlas a 4 °C hasta su uso.
nota: Se debe utilizar una técnica estéril y tiempos de almacenamiento cortos para evitar la contaminación y degradación de la IgG AuNR. Lo mejor es utilizar AuNR conjugados con anticuerpos dentro de las 24 horas posteriores a su conjugación.
>2. Preparación de las diapositivas de captura de EV
- Diluir los anticuerpos de captura de exosomas seleccionados a 0,025 mg/mL en PBS y añadir 1 μL/pocillo de esta dilución en un portaobjetos de proteína A/G de pocillos múltiples y, a continuación, incubar este portaobjetos a 37 °C durante 1 h en una cámara humidificada para permitir la unión de anticuerpos de captura a la proteína A/G inmovilizada en el portaobjetos.
- Aspirar pocillos para eliminar los anticuerpos no unidos y lavarlos tres veces mediante la adición y aspiración de 1 μL/pocillo de PBS. A continuación, cargue cada pocillo con 1 μL de tampón de bloqueo (consulte la Tabla de materiales) e incube el portaobjetos durante 2 h a 37 °C en una cámara humidificada para bloquear los sitios de unión a proteínas restantes.
- Aspire los pocillos para eliminar el tampón de bloqueo, lave los pocillos tres veces mediante la adición y aspiración de 1 μL/pocillo de PBS, y utilice inmediatamente los portaobjetos bloqueados para la captura y el análisis de exosomas.
>3. Preparación de la curva estándar
- Para cuantificar con precisión la abundancia absoluta o relativa de un subtipo específico de exosoma, el usuario debe generar una curva estándar con una población de exosomas puros que exprese uniformemente el biomarcador de superficie del exosoma de interés. Este estudio analiza la abundancia de exosomas que expresan una proteína de membrana asociada a la metástasis, el receptor de Ephrin A2, que tiene una relación reportada con el estadio y el pronóstico del cáncer >nota: Se sabe que la línea celular de cáncer de páncreas humano PANC-1 y sus exosomas expresan esta proteína, y se utilizaron exosomas aislados de esta línea celular para generar una curva estándar para cuantificar el número de exosomas que expresan esta proteína en muestras de exosomas complejos.
- Cultivar células durante 48 horas a 37 °C en medios de cultivo libres de suero para permitir la acumulación de exosomas en el medio, luego aislar los sobrenadantes de cultivo celular mediante centrifugación de cultivos en suspensión o aspiración directa de medios de cultivo de cultivos celulares adherentes.
- Centrifugar el medio recolectado a 2000 x g durante 30 min para eliminar los residuos y recuperar el sobrenadante.
- Filtre el sobrenadante de cultivo clarificado a través de una unidad de filtro de baja unión a proteínas de 0,45 μm de capacidad adecuada (por ejemplo, una unidad de filtración al vacío de poliéter sulfona de 250 mL).
- Concentrar el filtrado resultante por centrifugación a 3200 x g utilizando un sistema de filtro límite de peso molecular nominal de 100.000 μl hasta un volumen final de 250 μL. Recoja el volumen retenido de este filtro, luego lave el filtro con 200 μL de PBS y combine este volumen de lavado con el volumen de muestra de exosomas recolectado.
- Centrifugar esta muestra a 21.000 x g durante 45 minutos y recuperar cuidadosamente el sobrenadante, teniendo cuidado de no recoger ningún material precipitado.
- Centrifugar el sobrenadante recuperado a 100.000 x g durante 3 horas para precipitar los exosomas. Aspire el sobrenadante y recoja la bolita de exosoma en 100 μL de PBS.
- Almacene las suspensiones de exosomas resultantes a 4 °C si se utilizan dentro de las 24 horas o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
NOTA: No someta las muestras de exosomas a ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Cuantificar una alícuota de la suspensión de exosomas después de mezclarla mediante la medición directa del número de exosomas (por ejemplo, mediante análisis de seguimiento de nanopartículas o detección de pulsos resistivos sintonizables o midiendo la concentración de proteínas de los lisados de exosomas mediante un ensayo de ácido microbicinconínico, o un método equivalente, como medio para aproximar la cantidad de exosomas).
- Genere un conjunto de diluciones en serie de la suspensión de exosomas para permitir la comparación de la señal de nanopartículas con el número de exosomas de entrada o el contenido de proteínas.
- Transfiera 1 μL de cada patrón de exosoma a cada uno de sus pocillos replicados en la placa de ensayo.
NOTA: Las curvas estándar se pueden utilizar para calcular la pendiente de la línea de correlación entre la señal de nanopartículas y la concentración de exosomas para (1) evaluar el rendimiento del ensayo y (2) determinar la concentración relativa de exosomas objetivo en muestras experimentales.
>4. Procesamiento de muestras de plasma o suero humano
- Recoja muestras de plasma o suero por métodos estándar y almacene a -80 °C hasta que sea necesario para el análisis de exosomas. Descongele rápidamente las muestras en un baño de agua a temperatura ambiente. Mezcle repetidamente las muestras descongeladas por inversión para promover una suspensión homogénea.
NOTA: Los resultados de las muestras de suero y plasma pueden no ser equivalentes, ya que hay una liberación significativa de exosomas durante la reacción de coagulación.
- Centrifugar muestras de plasma o suero a 500 x g durante 15 min para precipitar agregados de proteínas y otros desechos. Transfiera una alícuota de la muestra de plasma o suero a un tubo nuevo y agregue PBS para generar una dilución 1:1. Mezcle la muestra diluida mediante un vórtice suave o una inversión, según corresponda. Transfiera 1 μL de cada plasma o suspensión sérica a cada uno de sus pocillos replicados en la placa de ensayo.
>5. Captura y detección de exosomas
- Cargue los pocillos de un portaobjetos de captura de EV bloqueado con 1 μL/pocillo de muestra de exosoma, utilizando 8 réplicas por muestra, e incube el portaobjetos durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Aspire todos los pocillos de muestra y luego agregue 1 μL/pocillo de PBS para lavar los pocillos y eliminar los exosomas no unidos y otros contaminantes de la muestra de exosomas cargada.
- Cargue los pocillos de muestra con 1 μL/pocillo de una suspensión de AuNR-IgG previamente preparada (consulte la sección 1 anterior) e incube el portaobjetos durante 2 h a 37 °C en una cámara humidificada. Aspire la solución de nanopartículas y lave el portaobjetos en PBS complementado con 0.01% Tween-20 (PBST) durante 10 minutos usando un mezclador, luego aspire y lave todos los pocillos de muestra con agua desionizada durante 10 min usando un mezclador giratorio y seque al aire para imágenes LMDFM posteriores><.
NOTA: Los coeficientes de variación (CV) entre ensayos se evalúan a partir de ocho réplicas de la misma muestra. Las muestras que presentan CV >20% se consideran no informativas y deben repetirse, si hay suficiente muestra.