Descelularización del complejo cardiopulmonar: una técnica para descelularizar el corazón y los pulmones a partir de un modelo murino

Abstract

Fuente: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Descelularización del Complejo Cardiopulmonar Murino. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra un método de producción de andamios de matriz extracelular descelularizada o ECM mediante la aplicación de perfusión anterógrada de detergentes a través de la vasculatura. Los andamios estructurales de la MEC se pueden utilizar para analizar la remodelación de la MEC asociada a la enfermedad cardiopulmonar.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Microcirugía post-mortem

1. Eutanasia al ratón usando una cámara de CO₂.
   1. Coloque el ratón en una cámara de 4 L, y comience a llenar con CO₂ al 100%, comenzando con 0,2 L/min durante 2 min, aumentando hasta alcanzar un flujo de 0,8 L/min después de 3 min. El ratón debe caer inconsciente durante los primeros 2 min, y luego la respiración debe cesar (generalmente alrededor de 5 min, pero el flujo se puede mantener según sea necesario). Confirme la muerte antes de continuar con el siguiente paso.
2. Afeitar el tórax, el abdomen y el dorso del ratón con la cortadora de pelo y desinfectar con etanol al 70%. El afeitado reduce en gran medida el número de artefactos debido a la presencia de vello, ya sea en las muestras para imágenes o análisis bioquímicos.
3. Sujete el ratón a una bandeja de poliestireno, extendiendo sus extremidades delanteras y traseras, así como su cabeza y cola. Colóquelo bajo el microscopio de microcirugía.
4. Con unas tijeras de patrón recto de Mayo, establezca el acceso quirúrgico con una incisión cutánea que vaya desde la región submandibular hasta la parte inferior del abdomen y diseccione subcutáneamente para exponer la pared torácica y el peritoneo.
5. Con unas tijeras microquirúrgicas, corte los músculos pectoral mayor y pectoral menor a lo largo del sexto espacio intercostal a ambos lados de la pared torácica.
6. Con unas tijeras de patrón recto, corte el esternón a lo largo de las incisiones anteriores y luego complete una esternotomía cortando el esternón a lo largo de su eje largo, luego eleve y sujete con alfileres ambos lados de la pared torácica para exponer el complejo cardiopulmonar.
7. Con micropinzas de punta redonda (o micropinzas de Dumont), extirpe el timo y el tejido adiposo circundante tirando delicadamente de sus aditamentos. Esto revelará los principales buques.
8. Con la cauterización, cauterizar la vena de cava descendente y, con unas tijeras rectas, cortar el esófago.
9. Con micropinzas afiladas, separe las venas braquiocefálicas y las arterias braquiocefálicas, carótidas comunes izquierdas y subclavias izquierdas del tejido subyacente para facilitar la ligadura y la cauterización.
10. Con el uso de un soporte de microagujas, micropinzas afiladas y sutura 9-0 colocan puntos de sutura por encima de la emergencia de las arterias braquiocefálica, carótida común izquierda y subclavia izquierda.
11. Cauterizar las venas braquiocefálicas.
12. Separe las glándulas salivales submandibulares a lo largo de la línea media para exponer los músculos del cuello y la tráquea. Separe los músculos para exponer el ligamento cricotiroideo. Con unas microtijeras, abra una entrada seccionando el ligamento.
13. Introduzca un catéter de 27 G en la tráquea y empuje suavemente hasta que la tráquea se ramifique en los bronquios (es decir, hasta que se encuentre resistencia al catéter, luego retroceda 3 mm). Tenga cuidado de no alterar los bronquios. Usando una sutura 6-0, coloque 3 puntos alrededor de la tráquea para asegurar el catéter.
14. Sección el ratón a la altura de la 12ª vértebra torácica. La aorta descendente corre anteriormente a la columna vertebral y debe seccionarse aquí junto con la columna. Separa la mitad inferior.
15. Cateterizar retrógradamente la aorta y empujar el catéter hasta que llegue al arco aórtico. Con la sutura 9-0, coloque 4 puntos alrededor de la aorta, comenzando 5 mm por debajo de la punta del catéter.

>2. Descelularización

1. Conecte el mouse a un sistema de bomba usando tubos de silicona y conectores Luer. Perfundir con agua desionizada a 200 μL/min durante 15 min. Mantenga este caudal durante la descelularización.
2. Cambie el agente de perfusión a desoxicolato de sodio (DOC) al 0,5% diluido en agua desionizada y perfunda durante la noche.
3. Cambie el agente de perfusión a dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% diluido en agua desionizada y perfunda durante 8 horas.
4. Perfundir con agua desionizada durante la noche para lavar SDS y DOC durante 24 h.
5. Resecar el corazón y los pulmones descelularizados seccionando sus uniones al tórax con unas tijeras curvas y almacenarlos en un tubo criogénico estéril con agua desionizada con penicilina-estreptomicina al 1% (v/v) y azida sódica 0,3 μM a 4 °C. Los andamios ECM pueden almacenarse durante al menos 12 semanas. Si el andamio se va a utilizar para análisis bioquímicos (por ejemplo, espectrometría de masas), congele rápidamente en nitrógeno líquido.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
microcirugía
Sutura 6-0, aguja de sección triangular (Vicryl)	Ethicon	6301124
Microsutura 9-0 (Safil)	B Braun	G1048611
Pinzas de Adson	Herramientas de Bellas Ciencias	11006-12
Pinzas Adson con dientes	Herramientas de Bellas Ciencias	11027-12
Soporte de microagujas Castroviejo	Herramientas de Bellas Ciencias	12061-01
Cámara de ventilación de CO2 para la eutanasia de ratones
Agua desionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de agua de laboratorio ultrapura)	Merck	ZIQ7000T0
Bandeja de poliestireno desechable (~30 × 50 cm)
Microscopio de disección (Greenough, con cuello de cisne de dos brazos)	Leica	S6 D
Microespátula de doble punta	Herramientas de Bellas Ciencias	10091-12
Micropinzas Dumont (dos)	Herramientas de Bellas Ciencias	11252-20
Micropinzas Dumont con puntas de 45°	Herramientas de Bellas Ciencias	11251-35
Cortapelos	Oster	76998-320-051
Portaagujas Halsey (con mordazas de carburo de tungsteno)	Herramientas de Bellas Ciencias	12500-12
Catéter intravenoso de calibre 24 (Insyte)	Bd	381512
Catéter intravenoso de calibre 26 (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Tijeras de mayonesa (corte duro, rectas)	Herramientas de Bellas Ciencias	14110-15
Micropinzas con puntas anilladas	Esculapio	FM571R
Tijeras de micromuelle (Vannas, curvas)	Herramientas de Bellas Ciencias	15001-08
Agujas (calibre 27; Microlance)	Bd	Año 21018
Toalla de papel (estéril) o servilleta quirúrgica
Tijeras dentadas (CeramaCut, rectas)	Herramientas de Bellas Ciencias	14958-09
Espátula (Freer-Yasargil)	Esculapio	OL166R
Jeringas (1 mL; Plastipak)	Bd	3021001
Jeringas (10 mL; Plastipak)	Bd	3021110
Tijeras para tendones (Walton)	Herramientas de Bellas Ciencias	14077-09
DESCELULARIZACIÓN
Etanol al 70% (alcohol absoluto 99,9%); el alcohol absoluto debe ajustarse al 70% (vol/vol) utilizando agua desionizada	ciruela	1680766
Agua desionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de agua de laboratorio ultrapura)	Merck	ZIQ7000T0
Accesorios macho de luer a tubo (1/8 de pulgada)	Instrumentos de precisión mundial	13158-100
Accesorios macho de luer a tubo (1/8 de pulgada)	Instrumentos de precisión mundial	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122
Bomba peristáltica (con 12 canales)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Tubo de silicona (con 2 mm de diámetro interno y 4 mm de diámetro exterior)	Ole Dich	31399
Azida de sodio	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Desoxicolato de sodio (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G