Aislamiento del epitelio de papilas circunvaladas (CVP) de un modelo de ratón: un procedimiento enzimático para separar el epitelio de CVP de la lengua de ratón

Resumen

Fuente: Shechtman, L. A. et al. Generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustativas de ratones adultos. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, describimos el aislamiento del epitelio de las papilas circunvaladas (CVP) de una lengua murina.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Aislamiento del epitelio CVP

1. Eutanasia de los ratones con asfixia por CO₂ de acuerdo con las regulaciones de la IACUC, seguido de un método secundario aprobado como toracotomía bilateral, luxación cervical, decapitación o exanguinación.
2. Use tijeras de disección grandes y estériles para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del suelo de la cavidad oral. Corta la lengua y recógela en solución salina estéril y helada tamponada con fosfato (dPBS) de Dulbecco con Ca²⁺ y Mg²⁺.
3. Retire y deseche la lengua anterior cortando justo la parte anterior de la eminencia intermolar con una cuchilla de afeitar (Figura 1A, línea discontinua). Use una toallita delicada para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.
4. Llene 1 ml de jeringa con 200-300 μL de solución inyectable de enzimas (concentración final: 2 mg/mL de colagenasa tipo-I y 5 mg/mL de dispasa II en Ca²⁺/Mg²⁺-containing dPBS, diluido a partir de soluciones madre de 10 mg/mL) e inserte una aguja de 30 G x 1/2 justo por encima de la eminencia intermolar (Figura 1B, flecha negra) hasta justo antes de la CVP (Figura 1B, caja negra). Inyecte la solución enzimática por debajo y en los bordes laterales de la CVP entre el epitelio y los tejidos subyacentes (lámina propia, músculo). Retire la jeringa lenta y continuamente de la lengua a medida que se realiza la inyección.
5. Incubar la lengua en Ca²⁺/Mg²⁺-free dPBS a temperatura ambiente durante exactamente 33 min.
6. Realice pequeños cortes en el epitelio bilateralmente y justo antes de la CVP con tijeras de disección extrafinas, y pele suavemente el epitelio levantándolo con pinzas finas. Una vez que el epitelio de la zanja esté libre del tejido conectivo subyacente, colóquelo en un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml prerrecubierto con FBS. Realice el recorte epitelial antes o después de separar el epitelio CVP (Figura 1C, D).

Resultados

Figura 1: Lengua disecada y epitelio CVP pelado. (A) Se diseca la lengua y se extirpa la lengua anterior cortándola justo por delante de la eminencia intermolar (línea discontinua), dejando la lengua posterior, que incluye la CVP (caja negra) (B) Se inserta una aguja justo por delante de la eminencia intermolar (flecha negra) y se inyecta una mezcla d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 mL de TB	Jeringa BD	309659
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con Ca²⁺ y Mg²⁺	Gibco	10010-023
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con Ca²⁺ y Mg²⁺	Ciencias de la Vida Sigma	D8662-500ML
Pinzas Dumont #5	Herramientas de Bellas Ciencias	11252-30
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	26140-079
Jeringa de 1 mL de TB	Jeringa BD	309659
Tubos de microcentrífuga de 2,0 mL	Científico de EE. UU	1420-2700
Tijeras quirúrgicas - Afiladas	Herramientas de Bellas Ciencias	14002-14
Tijeras Bonn extrafinas	Herramientas de Bellas Ciencias	14084-08
Temporizador/cronómetro de dígitos grandes	Fisher Científico	S407992
Microscopio estereoscópico	Zeiss	Stemi SV6
Tijeras de resorte Cohan-Vannas	Herramientas de Bellas Ciencias	15000-02
Colagenasa de Clostridium histolyticum, tipo I	Sigma Ciencias de la Vida	C0130-1G
Dispasa II (proteasa neutra, grado II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001

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