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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de microburbujas
- Preparación de microburbujas para inyección
nota: El asistente realiza este paso cuando se inicia la 'Inyección de Microburbujas (MB) en Embriones'. Cada embrión se inyecta una vez, y el tipo de microburbuja elegida para cada inyección debe ser seleccionada al azar por el asistente, de modo que todos los tipos de microburbujas se distribuyan uniformemente a lo largo del procedimiento, pero se administran en un orden aleatorio. Asegúrese de que el cirujano esté ciego al tipo de burbuja que se inyecta.
- Determine el volumen de solución de burbujas de stock necesario para producir una concentración final de 1 x 108 MB/mL en un volumen de 400 μL (calcule el volumen utilizando las concentraciones de stock). Alícuota el volumen correspondiente de solución salina en un tubo de microcentrífuga vacío.
- Agite suavemente el vial de microburbujas seleccionado y extraiga un volumen excesivo (~50 μL mayor que el calculado anteriormente) de la solución en una jeringa de 1 mL con la aguja de 21 G. Inyecte las microburbujas en un tubo de microcentrífuga vacío.
- Pipetear el volumen necesario de solución madre de microburbujas y añadir a la alícuota de solución salina. Mezclar agitando suavemente con la punta de la pipeta.
- Introduzca la solución de microburbujas diluida en una jeringa limpia con la aguja de 21 G. Retire la aguja, elimine las burbujas de aire de la jeringa y conecte el luer y el tubo. Empuje lentamente la solución hasta el extremo del tubo, asegurándose de no generar burbujas de aire.
- Inserte la jeringa en un conjunto de bombas de infusión de jeringa para dispensar las microburbujas a una velocidad de 20 μL/min para un volumen total de 20 μL. Coloque una aguja de vidrio tirada en el extremo del tubo. Mueva la bomba cerca de la etapa de inyección.
>2. Inyección de microburbujas en embriones
- Seleccione y extraiga al azar (con una cuchara perforada) un embrión de la placa de medios refrigerados. Colocar en la plata de disección situada en la platina de ecografía bajo el estereoscopio y retirar el saco vitelino y las membranas amnióticas con las pinzas finas, cortando/desgarrando por el lado que parece menos vascularizado (el lado antimesometrial). Esto se logra más fácilmente perforando un área adyacente a la región de la cabeza.
- Corta lo suficiente como para extraer el embrión desde adentro, pero no más. Estabilice las placas de disección con pequeños trozos de plastilina.
- Maniobra suavemente el saco alrededor del embrión. Coloque el embrión de lado, con la placenta y los vasos umbilicales al frente. Con los alfileres para insectos, sujete con alfileres el saco vitelino (se recomiendan 4 alfileres) y los bordes de la placenta según sea necesario para fijarlos en su lugar. Evite las embarcaciones importantes.
- Lavar el embrión con PBS precalentado a 45 °C hasta que el embrión reviva. Identificar la vena umbilical y su red vascular asociada. Coloque el plato de manera que la inyección se pueda realizar cómodamente.
nota: Una vez calentado, la sangre en el embrión comenzará a fluir, bombeando visiblemente en la arteria umbilical. Cuando comienza el flujo, las venas serán de un rojo brillante, y la sangre en ambos vasos parecerá rápidamente idéntica. Las ramas que surgen de la vena umbilical generalmente se superponen a las de la arteria umbilical en la superficie placentaria.
- Una vez que el embrión haya revivido, cúbralo (pero no la placenta) con gel US precalentado, asegurándose de eliminar delicadamente cualquier burbuja de aire (usando las pinzas finas) alrededor del embrión. Rellene el plato con PBS precalentado.
nota: Vigile el nivel de solución en las jeringas de PBS y de gel, y añada jeringas de reserva al vaso de precipitados calefactor según sea necesario.
- Monte la aguja de vidrio en una bola grande de plastilina en el borde de la placa de disección e inserte el extremo de la aguja en el PBS. Eligiendo una vena en la superficie coriónica del disco placentario, tan lejos de la rama principal como sea razonable, recorte la punta a la medida con unas tijeras. La inyección es más fácil si la punta se corta en un ligero ángulo. Retira los bordes irregulares del vaso con el borde de las tijeras de resorte.
- Con la bomba de jeringa, inyecte lentamente la solución de microburbujas a 20 μL/min en la aguja de vidrio hasta que todo el aire sea expulsado de la punta de la aguja y se pueda ver que las microburbujas fluyen libremente hacia el PBS. Detenga la bomba y reinicie para un volumen de inyección de 20 μL. No permita que el aire entre en el sistema vascular del embrión durante la inyección.
- Inserte suavemente la punta de la aguja de vidrio en una de las venas de la placenta y asegúrese de que esté inmóvil. Retire el cabezal del estereoscopio y coloque el transductor sobre el embrión. Inicie la toma de imágenes.