Aislamiento de bacterias conjuntivales comensales basado en hisopos: una técnica para aislar bacterias comensales de la conjuntiva de un modelo murino

Resumen

Fuente: Smith-Page, K. et al. Aislamiento e identificación conjuntivales comensales en ratones. J. Vis. Exp. (2021)

Este video describe una técnica basada en hisopos para aislar bacterias comensales viables de la conjuntiva ocular. La técnica se puede utilizar para perfilar el microbioma bacteriano comensal de la conjuntiva, que desempeña un papel defensivo contra los patógenos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de hisopos oculares, configuración del campo de trabajo, hisopado ocular de ratón y enriquecimiento de muestras

1. Prepare hisopos oculares estériles
   nota: Los hisopos oculares estériles son palillos de madera con una capa fina de guata de algodón y fabricados en casa.
   1. Autoclave la cantidad apropiada de guata de algodón y palillos de dientes para el número de ratones que se van a hisopar.
   2. Pellizca un trozo de guata de algodón de medio centímetro de largo con el pulgar y el índice. Desentrañe el bateo tirando de los bordes con los pulgares y los índices para formar una sola capa porosa plana, deteniéndose justo antes de que el bateo se deshaga (son aceptables pequeños trozos de algodón dispersos por todo el bateo estirado).
   3. Gire la guata alrededor de uno de los extremos afilados del palillo sosteniendo ligeramente la pieza estirada en la punta del palillo mientras se retuerce, vea la Figura 1. El hisopo ocular "completo" tendrá una capa muy delgada de algodón estirada sobre la punta, que se extiende aproximadamente de medio a un centímetro de distancia de la punta.
   4. Inserte los hisopos "completados" en un vaso de precipitados pequeño, con el hisopo hacia abajo y cúbralos. Autoclave.
2. Configurar el espacio de trabajo
   1. Prepare anestesia que contenga 2 mL de ketamina (100 mg/mL), 400 μL de xilacina (100 mg/mL) y 27,6 mL de solución salina estéril (0,9% de NaCl en dH₂O) en un tubo de centrífuga estéril estéril de 50 mL. Filtro esterilizador y anestesia alícuota para uso inmediato (puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes; permitir siempre que se equilibre a temperatura ambiente antes de su uso).
   2. Despeje y limpie el área de trabajo con desinfectante para minimizar la contaminación.
   3. Alícuota de 0,5 mL de medio estéril de infusión cerebro-corazón (BHI) en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL marcados (1 tubo por ratón y control); colóquelos en una gradilla de microcentrífuga. Coloque la rejilla sobre hielo.
   4. Configure el flujo de trabajo de la siguiente manera (de izquierda a derecha): estación de anestesia para ratones (jaula que contiene ratones experimentales, jaula estéril vacía, anestesia a temperatura ambiente, aguja de 25 G y jeringa de 1 mL), estación de hisopado ocular (BHI alícuota en hielo, hisopos oculares esterilizados, toallas de papel limpias, spray de isopropanol al 70%) y estación de enchapado (placas de agar sangre a temperatura ambiente, pipeta de 10 μL, Puntas desechables estériles de 10 μL, contenedor de residuos de riesgo biológico).
3. Hisopado ocular
   1. Administrar 10 μL de anestesia por 1 g de dosis de ketamina y xilacina de peso de ratón, respectivamente, por vía intraperitoneal a cada ratón adulto y colocarlo en una jaula esterilizada en autoclave. Pruebe la anestesia apretando la almohadilla del retropié; La ausencia de movimiento indica una anestesia adecuada.
   2. Asigne una mano para manipular solo ratones anestesiados y la otra mano para manejar solo el hisopo ocular y el cultivo. Para el hisopado, retire el ratón completamente anestesiado de la jaula; Colóquelo encima de una superficie de trabajo limpia colocada de lado con el ojo izquierdo expuesto. Rocíe las manos enguantadas con isopropanol, séquelas con una toalla de papel limpia.
   3. Destape el tubo de microcentrífuga BHI específicamente etiquetado con mano de manejo de medios dedicada. Vuelva a colocar el tubo en la rejilla de microcentrífuga sobre hielo. Sumerja la punta del hisopo ocular recubierta de algodón en BHI, retire el hisopo ocular del tubo girando la punta 2 veces contra el tubo interior para eliminar el exceso de líquido.
   4. Con la mano que maneja el mouse, sostenga suavemente el mouse por el pescuezo. Con la otra mano, coloque la punta del hisopo ocular contra la región conjuntival medial del ojo izquierdo, véase la figura 2A. Presione ligeramente el globo ocular y mueva el hisopo con un movimiento de lavado de ventana (Figura 2B) hacia adelante y hacia atrás, entre el párpado inferior y el ojo, 10 veces. Mantenga una presión constante.
   5. Sin tocar el pelaje, retire suavemente la punta del hisopo, perpendicular a donde se insertó, y coloque el hisopo con el lado de algodón hacia abajo directamente en un tubo de microcentrífuga etiquetado que contenga medios BHI. Aplique un colirio lubricante en el ojo hisopado.
   6. Regresa el ratón a la jaula.
   7. Deje reposar el hisopo durante 10 a 15 minutos en hielo y retire el hisopo ocular con la mano enguantada esterilizada mezclando la punta en el medio durante 10 rotaciones. Retire el hisopo girando la punta contra la pared interna del tubo de microcentrífuga durante 5 rotaciones. Deseche el hisopo en un recipiente de riesgo biológico.
   8. Repita los pasos 1.3.2 a 1.3.7 para cada ratón y para las muestras de control (hisopo de piel o pelaje). Esterilice los guantes adecuadamente entre cada hisopo.
4. enriquecimiento
   1. Enriquezca la muestra incubando el tubo estáticamente durante 1 h a 37 °C
   2. Durante la incubación, etiquete una tripticasa de soja a temperatura ambiente con una placa de agar sangre de oveja al 5% (placa TSA) por ratón y divídala por la mitad.
   3. Después de la incubación del cultivo con hisopo ocular, retire las muestras enriquecidas de la incubadora y colóquelas en hielo.
   4. Muestras de vórtice breves para mezclar y colocar de acuerdo con el esquema de la Figura 3A. Alícuota 10 μL de la muestra en la placa TSA e incline la placa para formar una tira, repita 2 veces.
   5. En el otro lado de la línea divisoria de la placa, puntee 10 μL de muestra en agar, repita 9 veces.
   6. Incubar las placas a 37 °C durante 18 h, 2 días y 4 días (en una cámara limpia que evite que las placas de agar se sequen). Cuente las colonias en tiras, anote la morfología y calcule las unidades formadoras de colonias (UFC) por hisopo para aislados morfológicamente similares. Fíjate en los puntos para ver si hay organismos únicos que no se capturan en tiras.

Resultados

Figura 1: Hisopo ocular interno.
(A) Se sostuvo un trozo delgado de guata de algodón tirado de aproximadamente 1 cm entre la punta del palillo estéril y el dedo índice y se hizo rodar el palillo mientras se mantenía una ligera presión contra el dedo índice hasta que el algodón se enrolló completamente sobre la punta del palillo. (B) Ejemplo de un ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Punta de pipeta de 0,1 a 10 μl	Científico de EE. UU	1110-300	Autoclave antes de usar
Pipeta Eppendorf de 0,5 a 10 μl	Fisher Científico	Teléfono 13-690-026
Jeringa de 1 ml	Fisher Científico	BD309623	1 jeringa para cada grupo de hisopos oculares
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	Científico de EE. UU	1615-5500	Autoclave antes de usar
Punta de pipeta de 1000 μ ml	Científico de EE. UU	1111-2021	Autoclave antes de usar
De 200 a 1000 μl de pipeta Gilson (P1000)	Fisher Científico	F123602G
Aguja de 25 g	Fisher Científico	14-826AA	1 aguja por grupo de hisopo ocular
3 % Peróxido de hidrógeno	Fisher Científico	S25359
Incubadora de 37 ° C	Equipos de laboratorio
70 % de isopropanol	Fisher Científico	PX1840-4
Inyección de Ana-Sed (xilacina 100 mg/ml)	Salud Animal de Santa Cruz	SC-362949Rx
Quemador Bunsen	Equipos de laboratorio
Toallas de papel limpias	Equipos de laboratorio
Moldeo de algodón/Algodón enrollado estéril	CVS
Ketamina (100 mg/ml)	Henry Schein	9950001
ratón	Laboratorios Jackson	C57/BL6J
Placas de Petri	Fisher Científico	08-757-12	Para placas de agar con sal de manitol
Medios de infusión cerebro-corazón RPI	Fisher Científico	50-488525	Prepare de acuerdo con las instrucciones y el autoclave
SteriFlip (0,22 μm de tamaño de poro de poliéster sulfona)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	Para esterilizar la anestesia
Jaula estéril para ratones	Equipos de laboratorio
Palillos de dientes (bambú redondo)	Elementos esenciales de la cocina		Autoclave antes de usar y preparación del hisopo
Agar Tripticasa de Soja II con 5% de Placas de Sangre de Oveja	Fisher Científico	4321261	Conservar a 4 °C hasta que esté listo para usar
Gotas oftálmicas de un solo uso	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Gotas Lubricantes para los Ojos, 28 viales, 0.02 fl oz. cada uno

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