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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Protocolo EHS
- La noche anterior al protocolo EHS, coloque el ratón en la cámara ambiental a temperatura ambiente (~25 °C, ≈30% de humedad relativa) para aclimatarse a la cámara.
- Utilice un sistema de adquisición de datos para recopilar la temperatura central continua (Tc), promediada a intervalos de 30 s durante la noche.
- En la mañana del protocolo EHS, asegúrese de que el ratón esté en o por debajo de un rango normal de temperatura diurna antes de aumentar la temperatura de la cámara (es decir, 36-37,5 °C). Esto asegura que el ratón no tenga fiebre y no haya experimentado un estrés excesivo durante este período.
- Una vez que el ratón esté estable y dentro de un rango de temperatura central normal en reposo, retire la comida y el agua y pese al animal. Cierre la puerta de la cámara y aumente la temperatura de la cámara a un objetivo de 37,5 °C y entre el 40 % y el 50 % de humedad relativa, o la temperatura y humedad ambiental deseadas. Verifique la temperatura y la humedad de la cámara con un monitor de temperatura y humedad calibrado.
- Rodee la cámara con una cortina opaca para mantener la luz y las molestias mínimas durante el protocolo. Supervise el ratón de forma continua durante el protocolo a través de cámaras remotas iluminadas por infrarrojos. Enfoque una segunda cámara en el monitor de temperatura y humedad, colocado cerca de la rueda de rodaje. Realice cualquier ajuste en el controlador para el punto de ajuste de la cámara ambiental para garantizar lecturas precisas de la temperatura cerca del animal.
- Una vez que la cámara haya alcanzado su temperatura objetivo medida por la segunda cámara en el monitor de temperatura (esto puede tardar ~ 30 minutos), abra rápidamente la puerta de la cámara y coloque el mouse en la rueda de funcionamiento forzado.
- Inicie el protocolo de rueda de marcha forzada a una velocidad de 2,5 m/min y aumente la velocidad 0,3 m/min cada 10 min hasta que el ratón alcance un Tc de 41 °C. Una vez que el ratón haya alcanzado esta temperatura central, permita que la velocidad permanezca constante hasta la limitación de los síntomas, caracterizada por una aparente pérdida de conciencia, una caída hacia atrás o un desmayo, y la incapacidad de seguir corriendo o agarrarse al volante. Confirme este punto de tiempo cuando el mouse tenga tres rotaciones hacia atrás en la rueda sin signos de una respuesta física. Alternativamente, identifique un punto final humanitario siguiendo las reglas locales de IACUC para determinar cuándo detener el protocolo (por ejemplo, cuando Tc ~43 °C). Este criterio de valoración está ligeramente por encima de la limitación de los síntomas en prácticamente todos los ratones.
- Para realizar el protocolo de enfriamiento rápido (R), una vez que el mouse alcance la limitación de síntomas, detenga la rueda y retírela inmediatamente de la rueda de funcionamiento forzado. Pesa al ratón y colócalo de nuevo en su jaula de origen para que se recupere a temperatura ambiente. Durante este tiempo, deje la puerta de la cámara abierta y vuelva a colocar el punto de ajuste de la incubadora a temperatura ambiente para permitir que la cámara se enfríe rápidamente. Este procedimiento da como resultado una supervivencia a largo plazo del >99%.