$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación del ratón
- Anestesiar al ratón
- Prepare pentobarbital sódico (50 mg/kg) en una jeringa.
- Agarre al ratón (macho C57BL/6 de 8 semanas) con la mano izquierda de modo que su vientre quede hacia arriba y su cabeza esté más baja que su cola. Desinfectar la piel abdominal con alcohol al 75%.
- Sosteniendo la jeringa en la mano derecha, perfore la línea blanca del abdomen con la aguja ligeramente hacia el lado derecho de la piel de 3 a 5 mm. Asegúrese de que la aguja de la jeringa y la piel estén en un ángulo de 45°, inyecte el pentobarbital lentamente en la cavidad abdominal. Después del afeitado, desinfecte alrededor del sitio de la incisión del ratón 3 veces alternativamente con alcohol al 75% y solución de clorhexidina.
- Compruebe si la anestesia fue exitosa por la falta de un reflejo de enderezamiento.
- Inyecte el isotiocianato de rodamina B-dextrano en la vena caudal.
- Prepare 100 μL de 10 mg/mL de isotiocianato de rodamina B-dextrano en una jeringa.
- Limpia la cola del ratón con alcohol al 75%.
- Sostenga la cola con la mano izquierda, sostenga la jeringa con la mano derecha con la aguja paralela a la vena e inyecte el tinte de 100 μL.
- Detenga el sangrado con un hisopo de algodón después de la inyección.
- Remoja el pelaje abdominal del ratón con una gasa humedecida con agua estéril y afeita el abdomen del ratón con una navaja, haciendo trazos en la dirección del pelaje. Después del afeitado, desinfecta alrededor del sitio de la incisión del ratón 3 veces alternativamente con alcohol al 75% y solución de clorhexidina.
- Después de limpiar una almohadilla térmica con alcohol al 75%, abra la almohadilla térmica y coloque el mouse boca arriba en la almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 ° C.
>2. Fijando el hígado de ratón con el marco de imágenes de órganos del cuerpo
NOTA: El marco comercial de imágenes de órganos aún no ha sido publicado.
- Coloque una ventosa limpia en una posición fija.
- Instale un dispositivo de imágenes de órganos (Figura 1) y limpie la almohadilla térmica y la ventosa con alcohol al 75%.
- Conecte la ventosa (5 mm de diámetro) a la manguera de la bomba de vacío y encienda la bomba de vacío.
- En una mesa estéril esterilizada con alcohol al 75%, se desinfecta alrededor del sitio de la incisión del ratón 3 veces alternativamente con alcohol al 75% y solución de clorhexidina, luego se desinfecta alrededor del sitio de la incisión del ratón 3 veces alternativamente con alcohol al 75% y solución de clorhexidina, luego se usan tijeras quirúrgicas para cortar 2 cm de piel del borde esternal inferior del ratón y exponer el hígado.
- Coloque el mouse junto con la almohadilla térmica en la base del soporte.
- Ajuste el dispositivo de imágenes de órganos para que la ventosa sostenga el hígado. A continuación, utilice una presión negativa de 30-35 kPa para la succión, de modo que el hígado se adhiera a la ventosa (Figura 2).
>3. Ajuste del microscopio de barrido láser multifotónico
- Encienda el microscopio multifotónico y seleccione el objetivo de 60x/1,00 W.
- Fije el marco y el mouse debajo de la lente del objetivo.
- Agregue una gota de solución salina normal que pueda cubrir toda la lente, que es el centro de la ventosa, y ajuste la lente del objetivo para que solo toque la solución salina normal.
- Haga doble clic en el icono de la computadora para encender el software láser y encender el interruptor. A continuación, mantenga pulsado el botón de encendido y el obturador durante 3 s.
- Ajuste la longitud de onda a 800 nm.
- Inicie el software operativo del microscopio usando la computadora.
- Para la configuración de adquisición, establezca Láser 800.
