Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de aparatos de solución y perfusión
- Ensamble un aparato Langendorff de flujo constante (disponible comercialmente o de fabricación propia). La Figura 1 proporciona un esquema simple.
- Prepare las soluciones de acuerdo con los reactivos que figuran en la Tabla 1 y la Tabla 2.
- Abra el baño de agua circulante y ajuste una temperatura de entrada adecuada (42,7 °C en nuestro laboratorio) para garantizar que el flujo de salida del sistema de circulación de perfusión de la cánula alcance los 37 °C.
- Limpie el sistema de perfusión haciendo circular agua desionizada. Si se requiere una condición estéril, haga pasar etanol al 75% a través del sistema de perfusión durante 15 minutos, seguido de agua desionizada (al menos 10 ciclos para evitar los efectos de toxicidad del alcohol en el corazón).
- Mida el tiempo y el volumen de un ciclo del sistema de circulación de perfusión para determinar cuántos mililitros de solución de Tyrode oxigenada se cargarán en el siguiente paso de perfusión.
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con el método deseado.
- Ajuste el caudal del sistema de perfusión de perfusión a 4 mL/min.
- Prepare dos placas de Petri limpias de 35 mm, una que contenga la solución de Tyrode (placa de Petri 1) y la otra que contenga la solución 1 (placa de Petri 2).
- Prepare una jeringa de 1 ml llena de solución 1 y una aguja de cánula de acero romo de 20 G con una muesca desde donde la distancia sea de 1 mm hasta la punta. Prepare un nudo suelto con sutura 3-0 al eje de la cánula. Regule el campo de visión del microscopio estereoscópico y asegúrese de que la punta de la cánula esté por debajo de la superficie líquida de la placa de Petri 2.
>2. Preparación animal
- Administrar heparina (concentración, 1.000 UI/mL; 0,2 mL/ratón) por vía intraperitoneal a los ratones para evitar la formación de coágulos sanguíneos. Después de 10 minutos, anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico (50 mg/kg, inyección I.P.) y asegurarse de que los ratones dejen de responder a los pellizcos de la cola y los dedos de los pies. Realizar luxación cervical 20 min después de la administración de heparina.
- Transfiera los ratones a la plataforma quirúrgica, fije los ratones en posición supina, esterilice el pecho con etanol al 75% y séquelo con una gasa o una servilleta.
>3. Escisión del corazón y canulación de la aorta
- Levante la piel del xifoides con pinzas de tejido y haga una pequeña incisión lateral a través de la piel con unas tijeras de tejido. Realice una disección roma entre la piel y la fascia y extienda la incisión de la piel en forma de V hacia las axilas en ambos lados.
- Continúe el mismo trazo de incisión a través de la caja torácica y luego, desvíe la caja torácica hacia arriba sujetando el esternón con pinzas de tejido para exponer completamente el corazón y los pulmones.
- Despegue el pericardio con una pinza curva. Desgarre la glándula timo hacia ambos lados con dos pinzas curvas si cubre los vasos grandes. Tire suavemente de la base del corazón hacia la cola con pinzas curvadas hasta que se pueda ver un vaso sanguíneo en forma de "Y" (la aorta y sus arterias ramificadas).
- Para reservar diferentes longitudes de la aorta para la canulación y la comparación, se realizó un transecto de la aorta en la arteria carótida común izquierda (línea verde en la Figura 2) y se cortó la arteria braquiocefálica al mismo tiempo en algunos ratones. Transecto en la aorta ascendente en otros ratones (línea negra en la Figura 2).
nota: Para aquellos que son nuevos en este procedimiento, este paso también se puede realizar bajo un microscopio estereoscópico.
- Extirpe el corazón e inmerérjalo inmediatamente en la placa de Petri 1 para lavar y bombear la sangre residual.
- Transfiera el corazón a la placa de Petri 2 y recorte el tejido sobrante con unas tijeras finas de iris si es necesario. Para aquellos que son nuevos en este procedimiento, realicen este paso bajo el microscopio estereoscópico para evitar cortar erróneamente la aorta u otras estructuras del corazón.
- Empuje la jeringa para expulsar las burbujas de aire antes de la canulación de la aorta. Realizar la canulación retrógrada de la aorta con la ayuda de dos pinzas de atación rectas (mandíbulas lisas) bajo el microscopio estereoscópico. Asegúrese de que todo el proceso de canulación esté debajo de la superficie líquida.
- Evite penetrar las válvulas aórticas y ajuste las profundidades a la aorta ascendente (el ratón al que se le transcribió la aorta en la arteria carótida común izquierda) y a la raíz aórtica (el ratón al que se le transsectó la aorta en la aorta ascendente), respectivamente.
nota: La profundidad de la canulación de la aorta (denominada simplemente profundidad) se define aquí como la posición en la que la punta de la cánula está en la aorta o donde la aorta está ligada.
- Ligue la aorta con la sutura pre-nudo 3-0 a la muesca de la cánula. Presione suavemente el contenido de la jeringa para enjuagar la sangre residual.
nota: La sangre saldrá de las arterias coronarias y se desprenderá de las venas dorsales si la profundidad está correctamente colocada. El corazón y los apéndices auriculares se expandirán y se pondrán pálidos.
- Retire y conecte la cánula al aparato de Langendorff. Una vez más, tenga cuidado de evitar que entren burbujas de aire en el corazón.
nota: Tenga en cuenta que el tiempo desde la toracotomía hasta la perfusión inicial no debe exceder los 5 minutos.
- Para la perfusión cardíaca, primero, prepare y perfunja la solución oxigenada de Tyrode durante aproximadamente 10 s (el volumen de líquido que corre 10 s en el sistema utilizado en este protocolo es de aproximadamente 0,7 mL) si hay sangre residual en las aurículas, y luego cambie a la solución 1. Sin embargo, simplemente perfunde con la solución 1 si no hay sangre residual en las aurículas. Perfunde el corazón durante aproximadamente 2 min.
Tabla 1. Soluciones para el aislamiento de CM de ratón adulto.
| solución | Contenido (concentración final en mmol/L, si no se especifica lo contrario) | nombrado |
| Solución de perfusión (solución 1) | 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2 HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurina, 5 Glucosa, 10 2,3-butanediona monoxima (BDM) | Que se puede almacenar durante 3 días a 4 °C. Se añaden glucosa, taurina y BDM el día del experimento. Prepare 200 mL de solución de perfusión para cada corazón. |
| Solución de Tyrode (solución 2) | 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 glucosa | Que se puede almacenar durante 3 días a 4 °C. CaCl2 y glucosa se agregan el día del experimento, ajuste el pH a 7.3-7.4 con NaOH saturado a temperatura ambiente (28-30 °C) con un medidor de PH. |
Tabla 2. Soluciones para el aislamiento y almacenamiento de CM de ratones adultos.
| solución | contenido | nombrado |
| Solución de digestión (solución 3) | 25 mL solución 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg colagenasa II, 50μL (2,5 % 10×) de tripsina | Para cada corazón |
| Detener la solución 1 (solución 4) | 9 mL solución 1, 1 mL FBS (Suero Fetal Bovino), 4μL 100 mM/L CaCl2 | Para cada corazón |
| Detener la solución 2 (solución 5) | 9,5 mL solución 1, 0,5 mL FBS (Suero Fetal Bovino), 4μL 100 mM/L CaCl2 | Para cada corazón |
| Solución de resuspensión celular (solución 6) | 13 mL solución 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) a una dosis que puede formar una capa delgada que cubre la superficie del líquido | Para cada corazón |
