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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación antes del aislamiento de las células valvulares de ratones adultos
- Limpie y esterilice todo el instrumental quirúrgico que se muestra en la Figura 1A utilizando etanol al 70% v/v y posteriormente esterilizándolos en autoclave durante 30 min. Limpie el espacio de trabajo quirúrgico con etanol al 70%.
- Añadir 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Prepare una alícuota de 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Mantén las soluciones en hielo.
- Prepare soluciones de colagenasa de 1 mg/mL y 4,5 mg/mL, y use 5 mL de cada solución en tubos de 15 mL para realizar todo el procedimiento. Para preparar 5 mL de colagenasa de 1 mg/mL, mezcle 5 mg de colagenasa con 2,5 mL de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, libre de suero fetal bovino (FBS)) y 2,5 mL de HEPES de 10 mM suplementado con antibióticos (1% de penicilina-estreptomicina del paso 1.2). Filtre las soluciones a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier contaminación.
nota: Mantenga las soluciones en hielo para proteger las enzimas.
- Calentar la solución DMEM a 37 °C antes de usarla en todos los pasos que se describen a continuación. Prepare el medio completo suplementando DMEM con penicilina-estreptomicina al 1%, piruvato de sodio al 1%, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reactivo de eliminación de micoplasmas (consulte la Tabla de materiales) y FBS al 10%.
>2. Aislamiento de celdas de válvulas
- Para obtener10 6 células para el experimento, use cinco ratones de 8 semanas de edad (mínimo de tres). Coloque el ratón en una cámara de inducción junto con un pequeño trozo de papel de seda empapado con 1 mL de isoflurano, pero no permita el contacto con el tejido. Para confirmar que el animal está completamente anestesiado; Verifique el reflejo de pellizco del dedo del pie y luego eutanasiar al ratón por dislocación cervical. Use isoflurano para aliviar cualquier dolor antes de la luxación cervical, ya que el procedimiento descrito a continuación es terminal.
- Coloque el ratón en una plataforma de disección y fije las patas con cánulas para mantenerlo en su lugar. Limpiar el tórax y el abdomen con etanol; Abre el abdomen y el pecho con unas tijeras. Con unas tijeras quirúrgicas pequeñas, corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo para desangrar al ratón. Perfunda el corazón con 10 mL de PBS frío 1x para eliminar la sangre del corazón.
- Corte el corazón y manténgalo a 3 mm de la aorta ascendente como se muestra en la Figura 1B. Diseccionar la válvula aórtica con un microscopio estereoscópico. Corte el corazón horizontalmente en el centro de los ventrículos (Figura 1C). Corte el ventrículo izquierdo hacia la aorta y diseccione cuidadosamente la válvula aórtica (Figura 1D-F). Agrupe las válvulas en una pequeña placa de cultivo de tejidos de 35 mm.
- Lavar las válvulas aisladas en una placa de cultivo celular de 75 mm con 5 mL de HEPES frío (10 mM) suplementado con antibióticos (1% de penicilina-estreptomicina) para extraer la sangre (Figura 2). Prepare dos tubos de 15 mL de colagenasa, 1 mg/mL y 4,5 mg/mL como se describe anteriormente en el paso 1.3.
nota: Después de la disección, manipule las válvulas aisladas en una campana de bioseguridad estéril para minimizar la contaminación.
- Incubar las válvulas en colagenasa tipo I (1 mg/mL) durante 30 min a 37 °C con agitación continua (Figura 2). Centrifugar el tubo durante 5 min a 150 × g, lavar el pellet una vez con 2 mL de HEPES (10 mM) y vórtice durante 30 s a alta velocidad. Vierta el contenido de este tubo en una placa de cultivo de 35 mm y transfiera con cuidado los fragmentos de tejido con pinzas finas a un tubo nuevo.
nota: En esta etapa, las CIC aún no están disociadas del tejido y el pellet contiene trozos de tejido. Para evitar la contaminación con células endoteliales, no centrifugar después del vórtice en el paso 2.5.
- Incubar el pellet en un tubo de 15 mL con 5 mL de colagenasa tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C bajo agitación continua durante 35 min. Volver a suspender las células con una pipeta de 1 mL para separar las células y centrifugar a 150 × g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 mL de DMEM completo. Centrifugar a 150 × g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso dos veces para limpiar las celdas.
nota: El pellet todavía tendrá algunos fragmentos de tejido.
- Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo y coloque las células en un pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos en una cantidad mínima de medio para facilitar su fijación a la placa de cultivo. Deje las células, sin tocarlas, en una incubadora a 37 °C con un 5% de dióxido de carbono.
- Después de 3 días, revise las células bajo el microscopio para verificar un buen crecimiento cerca de los restos de tejido. Una vez que 1.000 células sean visibles bajo el microscopio, retire cuidadosamente los restos de tejido con pinzas esterilizadas en autoclave y cambie el medio.
nota: La placa no debe ser alterada; Si no se observa el número requerido de células, vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora durante otros 2 días.
